ATG7 und ATG14 beschränken die zytosolische und phagosomale Replikation von Mycobacterium tuberculosis in menschlichen Makrophagen

Nature Microbiology Band 8, Seiten 803–818 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Autophagie ist ein zellulärer angeborener Immunabwehrmechanismus gegen intrazelluläre Mikroorganismen, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Wie kanonische und nichtkanonische Autophagie zur Kontrolle der Mtb-Infektion in Phagosomen und im Zytosol funktioniert, bleibt ungeklärt. Makrophagen sind beim Menschen die Hauptwirtszelle für Mtb. Hier untersuchten wir die Beiträge der kanonischen und nicht-kanonischen Autophagie in den genetisch beherrschbaren, vom Menschen abgeleiteten pluripotenten Stammzellen-Makrophagen (iPSDM) unter Verwendung einer Reihe von Mtb-Mutanten, die im gleichen genetischen Hintergrund wie der häufige Laborstamm H37Rv erzeugt wurden. Wir haben die Replikation von Mtb-Mutanten, die entweder keine kanonische Autophagie (Mtb ΔesxBA) auslösen können oder Berichten zufolge nicht in der Lage sind, nicht-kanonische Autophagie (Mtb ΔcpsA) in iPSDM ohne ATG7 oder ATG14 zu blockieren, mithilfe der Einzelzell-High-Content-Bildgebung überwacht. Wir berichten, dass die Deletion von ATG7 durch CRISPR-Cas9 in iPSDM zu einer erhöhten Replikation von Wildtyp-Mtb führte, nicht jedoch von Mtb ΔesxBA oder Mtb ΔcpsA. Wir zeigen, dass die Deletion von ATG14 zu einer erhöhten Replikation sowohl des Mtb-Wildtyps als auch des mutierten Mtb-ΔesxBA führte. Mithilfe von Mtb-Reportern und quantitativer Bildgebung identifizierten wir eine Rolle von ATG14 bei der Regulierung der Fusion von Phagosomen, die Mtb enthalten, mit Lysosomen, wodurch eine intrazelluläre Bakterienrestriktion ermöglicht wird. Wir kommen zu dem Schluss, dass sowohl ATG7 als auch ATG14 für die Einschränkung der Mtb-Replikation in menschlichen Makrophagen erforderlich sind.

Zwei Hauptwege der Autophagie sind an der Abwehr des Wirts gegen intrazelluläre Krankheitserreger beteiligt: ​​der kanonische Weg der Xenophagie1,2,3 und ein nicht-kanonischer Weg namens LC3-assoziierte Phagozytose (LAP)4,5. Xenophagie ist eine spezielle Form der Makroautophagie, bei der die De-novo-Biogenese von Autophagosomen Bakterien in doppelmembranigen Autophagosomen einfängt, die auf Lysosomen abzielen6. Das Aufbrechen von Bakterien, die Phagosomen enthalten, führt dazu, dass luminale Kohlenhydrateinheiten dem Zytosol ausgesetzt werden, die von Galectinen erkannt werden, um Xenophagie auszulösen7,8. Xenophagie kann auch durch Ubiquitinierung von Wirts- und Pathogenproteinen und Lipopolysacchariden während einer Membranschädigung sowie nach dem Entweichen von Bakterien in das Zytosol ausgelöst werden9,10. Bei LAP werden Mitglieder der Atg8-Familie von Autophagieproteinen direkt an einzelne Phagosomenmembranen konjugiert, um die Phagosomenreifung zu ermöglichen4. Es hat sich gezeigt, dass die Ausrichtung von Krankheitserregern auf LAP zu unterschiedlichen Ergebnissen führt. In einigen Fällen ist es restriktiv, in anderen Fällen fördert es jedoch die Bakterienreplikation5. Mechanistisch erfordert LAP die LC3-Lipidierungsmaschinerie von Atg7, Atg3 und Atg5-12-16L1 sowie den PI3K-Komplex (Beclin1, UVRAG, Rubicon, Vps34 und Atg101) und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) durch die NADPH-Oxidase . LAP benötigt weder die Komponenten des ULK1-Komplexes noch Atg14, die beide für die Xenophagie essentiell sind11. Trotz jüngster Fortschritte ist die räumliche und zeitliche Regulierung zwischen kanonischen (Xenophagie) und nicht-kanonischen (LAP) Autophagie-Reaktionen während einer Infektion mit intrazellulären Krankheitserregern bei menschlichen Makrophagen nach wie vor nur unzureichend charakterisiert.

Es gibt Hinweise darauf, dass Xenophagie und LAP eine Rolle bei der Reaktion von Wirtsmakrophagen auf eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb) spielen2,12. Andererseits transportiert Mtb mehrere bakterielle Effektoren in Wirtszellen, die die Autophagie stören13. Darüber hinaus schädigt Mtb die phagosomale Membran und gelangt durch die koordinierte Wirkung des ESX-1-Typ-7-Sekretionssystems (T7SS), das in der Differenzregion 1 (RD1)14,15,16 kodiert ist, und den Zellwandlipiden Phthioceroldimycocerosate in das Zytosol des Wirts (PDIM)17,18,19,20. Die Ausrichtung von Mtb auf die Autophagie und die Umgehung durch Mtb ist hochdynamisch und zeitlich reguliert13,21. Mtb-induzierte Schäden an der Phagosomalmembran induzieren komplexe tubulovesikuläre autophagosomale Strukturen (LC3-TVS)22. Nach der Induktion von LC3-TVS trennt sich Mtb von autophagosomalen Membranen, entgeht der Xenophagie und entweicht in das Zytosol22. Die verbleibende phagosomale Subpopulation von Mtb manipuliert aktiv den Phagosomenreifungsweg13. Bei einer Subpopulation von Bakterien, die Zugang zum Zytosol haben, ist die Ausrichtung auf die Xenophagie jedoch wahrscheinlich erfolgreich und führt zu deren Einschränkung. LAP trägt nicht zur Einschränkung des Mtb-Wildtyps (WT) in Mausmakrophagen bei, da Mtb diesen Weg durch die Sekretion von CpsA untergräbt. CpsA blockiert die Wirkung der NADPH-Oxidase und reduziert so die phagosomale ROS- und LAP-Aktivierung12.

Bei Mausmakrophagen erhöht die Störung des Autophagie-Signalwegs durch Knockout (KO) wichtiger selektiver Autophagie-Gene die Mtb-Replikation12,23,24,25. Allerdings veränderte die in vivo bedingte KO mehrerer muriner Autophagieproteine ​​weder die Mtb-Bakterienlast noch das Überleben der Maus nach der Infektion26. Obwohl klar ist, dass Mtb durch Autophagie-Reaktionen in vitro effizient eingeschränkt werden kann, führten diese In-vivo-Ergebnisse zu der Annahme, dass Autophagie für die Kontrolle von Mtb im Tuberkulose (TB)-Mausmodell27 nicht wichtig ist, was möglicherweise auf eine effiziente Subversion in vivo zurückzuführen ist ; Daher bleibt die Rolle der Autophagie bei Tuberkulose unklar.

Aufgrund des Mangels an robusten genetischen Systemen war es bisher nicht möglich, spezifische Gen-Deletion-Ansätze zur Untersuchung der Rolle der Autophagie in primären menschlichen Makrophagen zu verwenden. Solche Ansätze könnten unser Verständnis der Autophagie bei Infektionen verbessern, da Knockdowns oder bedingte KO-Strategien zu einer unvollständigen Entfernung aller Autophagieprozesse in Wirtszellen führen können. Um die Rolle der Autophagie bei der Abtötung von Mtb beim Menschen besser zu verstehen, haben wir in diesem Artikel ein menschliches Makrophagenzellmodell entwickelt und die Rolle von ATG7 und ATG14 bei der Bakterienreplikation und dem Zelltod untersucht.

Um die Rolle der Autophagie-Reaktion auf eine Mtb-Infektion in menschlichen Makrophagen zu untersuchen und Inkonsistenzen im Zusammenhang mit Veränderungen im genetischen Hintergrund des Elternstamms zu reduzieren, haben wir im Mtb-H37Rv-Hintergrund zwei Gen-Deletionsmutanten und verwandte komplementäre Stämme erzeugt. Zuerst haben wir einen Stamm erzeugt, dem sowohl EsxA als auch EsxB (Mtb ΔesxBA) fehlen, zwei Substrate des ESX-1 T7SS, die für Phagosomenschäden und die Induktion von Xenophagie verantwortlich sind (Abb. 1a)28,29. Die Deletion von esxBA wurde durch Untersuchung der EsxA- und EsxB-Proteine ​​sowohl im Ganzzelllysat als auch im Kulturfiltrat mittels Western Blot bestätigt (Abb. 1b). Wie erwartet wurde weder im Kulturfiltrat noch im Ganzzelllysat von Mtb ΔesxBA oder Mtb ΔRD1, das als Kontrolle diente, EsxA oder EsxB nachgewiesen. Die Mtb-ΔesxBA-Mutante wurde ergänzt, indem sowohl die Mtb-H37Rv-esxB- als auch die esxA-Expression unter die Kontrolle des starken Psmyc-Promotors30 an der MS6-Stelle im Chromosom gestellt wurde. Die Expression und Sekretion der komplementierten EsxA- und EsxB-Proteine ​​wurde durch Western Blot validiert (Abb. 1b). Als nächstes erzeugten wir einen zweiten mutierten Stamm ohne CpsA (Mtb ΔcpsA), der Berichten zufolge nicht in der Lage ist, LAP in Makrophagen zu blockieren (Abb. 1c). Die Mtb-ΔcpsA-Mutante wurde durch chromosomale Integration des cpsA-Gens ergänzt, das an der MS6-Stelle unter die Kontrolle des starken hsp60-Promotors gestellt wurde. Die Produktion und Sekretion von EsxA und EsxB wurde in Mtb ΔcpsA und Mtb ΔcpsA:cpsA nicht beeinflusst (Abb. 1d). Wichtig ist, dass die In-vitro-Replikationsprofile (Abb. 1e, f) und die PDIM-Produktion dieser Stämme in 7H9-Flüssigmedien ähnlich waren, was darauf hindeutet, dass die extrazelluläre Replikation nicht beeinflusst wurde (Abb. 1g). Alle erzeugten rekombinanten Stämme wurden dann mit Vektoren transformiert, die das E2-Crimson-Fluoreszenzprotein codieren, und ihre Replikationsprofile in iPSDM wurden durch High-Content-Bildgebung und Einzelzellanalyse weiter analysiert. Die Aufnahme von Mtb durch Makrophagen wurde durch esxA/esxB- oder cpsA-Deletionen nicht beeinflusst (Abb. 1h). Allerdings war die Replikation von Mtb ΔesxBA bei iPSDM nach 96 Stunden Infektion reduziert (Abb. 1i,j). Eine ähnliche Verringerung wurde nach Infektion von iPSDM mit der Mtb-ΔcpsA-Mutante beobachtet (Abb. 1k, l). Die Komplementierung von Mtb ΔesxBA und Mtb ΔcpsA mit funktionellen esxBA- oder cpsA-Genen stellte ihre Fähigkeit zur Replikation in Makrophagen wieder her (Abb. 1i – l).

a, c, Mtb esxBA-rv3874-75-Locus (a) und cpsA-rv3484-Locus (c) in Mtb WT und den jeweiligen Deletionsstämmen. Schwarze Halbpfeile zeigen die Primerpositionen (CmR, Chloramphenicol-Resistenz; ZeoR, Zeocin-Resistenz; Prom., groEL-Promotor). b,d, Western Blot von EsxA und EsxB aus Gesamtzelllysaten und Kulturfiltraten von Mtb WT, ΔRD1, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (n = 3) (b) oder Mtb WT, ΔcpsA und ΔcpsA:cpsA-Stämmen (n = 1). ) (D). Als Beladungskontrolle wurde Ag85 verwendet. e, Wachstumskurven von Mtb WT, ΔesxBA und ΔesxBA:BA. f, Wachstumskurven der Stämme Mtb WT, ΔcpsA und ΔcpsA:cpsA. g, Dünnschichtchromatographie-Analyse von PDIM aus Mtb WT-, ΔcpsA-, ΔcpsA:cpsA-, ΔesxBA- und ΔesxBA:BA-Kulturen (n = 1). Als Kontrollen wurden gereinigtes PDIM und Extrakte aus Mtb-ΔPDIM verwendet. h, Quantitative Analyse der Mtb WT, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (oben) und Mtb WT, ΔcpsA, ΔcpsA:cpsA (unten) Fläche pro einzelne Zelle, 2 Stunden nach der Infektion. Repräsentative Daten von drei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (Sem) angezeigt. Auf die einfache ANOVA folgte der Mehrfachvergleichstest nach Šídák. NS, nicht signifikant. i, Schnappschuss eines lebenden iPSDM, der 96 Stunden nach der Infektion mit Mtb WT, ΔesxBA und ΔesxBA:BA infiziert war. Kernfärbung (blau) und Mtb-E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 50 µm. j, Quantitative Analyse der Mtb-Replikation nach Infektion mit Mtb WT, ΔesxBA und ΔesxBA:BA. Die MTB-Fläche pro Zelle wurde als Faltungsänderung relativ zu 2 Stunden nach der Infektion berechnet. Repräsentative Daten von drei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt vom Mehrfachvergleichstest nach Šídák. ***P < 0,001; NS, nicht signifikant. k, Repräsentative Bilder von fixiertem iPSDM, das 96 Stunden nach der Infektion mit Mtb WT, ΔcpsA und ΔcpsA:cpsA infiziert war. Kernfärbung (blau) und Mtb-E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 50 µm. l, Quantitative Analyse der Mtb-Replikation nach Infektion mit Mtb WT, ΔcpsA und ΔcpsA:cpsA. Die MTB-Fläche pro Zelle wurde als Faltungsänderung relativ zu 2 Stunden nach der Infektion berechnet. Repräsentative Daten von drei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest **P < 0,002; NS, nicht signifikant.

Quelldaten

Als nächstes verwendeten wir geclusterte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR)-Cas9, um entweder ATG7 oder ATG14 in induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auszuschalten, um kanonische und nicht-kanonische Autophagie-Reaktionen auf Mtb zu untersuchen (Erweiterte Daten, Abb. 1a, d). . Wir haben getestet, ob die Autophagie-Reaktionen im ATG7- und ATG14-KO-iPSC (bezeichnet als ATG7–/– und ATG14–/–) verändert waren. Das WT-iPSC (bezeichnet als ATG7+/+ und ATG14+/+) akkumulierte LC3B-II als Reaktion auf die kanonische Autophagie-Induktion durch Hungern, die Blockade des Autophagosomenabbaus durch Bafilomycin A1 (BafA1) oder die Induktion nicht-kanonischer Autophagie durch Monensin-Behandlung31, wohingegen ATG7 KO iPSC wies nicht nachweisbare LC3B-II-Spiegel auf (Extended Data Abb. 1b, e). Darüber hinaus zeigte ATG7 KO iPSC im Vergleich zu WT iPSC unter allen Bedingungen eine Akkumulation von p62 (Extended Data Abb. 1b). Wie erwartet zeigte ATG14 KO iPSC im Vergleich zu WT iPSC erhöhte p62-Spiegel, selbst im gefütterten Zustand, und veränderte die LC3B-II-Spiegel weder als Reaktion auf Hunger noch auf BafA1 (Extended Data, Abb. 1e). Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit Monensin zu einem Anstieg der LC3B-II-Spiegel und zu nicht nachweisbaren LC3B-I-Spiegeln sowohl im WT- als auch im ATG14-KO-iPSC (Extended Data, Abb. 1e). Als nächstes testeten wir, ob die Differenzierung in iPSDM die Autophagie-Phänotypen des ATG7-KO- und ATG14-KO-iPSC beeinflusst. Wie erwartet zeigte ATG7 KO iPSDM eine fehlerhafte LC3B-Verarbeitung und erhöhte p62-Spiegel im Ruhezustand (Extended Data Abb. 1c). Funktionell zeigte das ATG14 KO iPSDM keine wesentlichen Veränderungen in der LC3B-Verarbeitung nach Hunger oder BafA1-Behandlung (Extended Data Abb. 1f). Die Induktion nicht-kanonischer Autophagie mit Monensin erhöhte die LC3B-Verarbeitung sowohl im WT- als auch im ATG14-KO-iPSDM, und die p62-Spiegel blieben unter allen getesteten Bedingungen weitgehend unverändert (Erweiterte Daten, Abb. 1f). Als nächstes wurden die iPSDM-Klone mittels Durchflusszytometrie hinsichtlich der Oberflächenexpression von Makrophagenmarkern charakterisiert. Nach der M-CSF-induzierten Differenzierung zeigten alle iPSDM eine Verringerung von CD14 und einen Anstieg der CD11b-Oberflächenexpressionsniveaus, wie zuvor gezeigt22,32 (Extended Data Abb. 2). Bei der Differenzierung war die ATG7- und ATG14-KO-iPSDM-Oberflächenexpression von CD163 und CD206 ähnlich wie bei WT-iPSDM, während die CD169-Spiegel sowohl bei ATG7- als auch bei ATG14-KO-iPSDM höher waren (Erweiterte Daten, Abb. 2).

Anschließend infizierten wir ATG7 KO iPSDM mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA, die E2-Crimson exprimieren, und analysierten die bakterielle Replikation durch Einzelzell-High-Content-Bildgebung. Das Mtb-Signal pro Makrophage stieg bei ATG7-KO-iPSDM etwa um das Dreifache an, im Vergleich zu WT-iPSDM um das Zweifache nach 96 Stunden Infektion (Abb. 2a, b). Diese Unterschiede waren nicht auf eine Änderung der Bakterienaufnahme oder -verbreitung in ATG7 KO iPSDM zurückzuführen, da die Bakterienfläche pro Zelle bei der Aufnahme und der Prozentsatz infizierter Zellen zu allen Zeitpunkten in beiden genetischen Hintergründen ähnlich waren (Extended Data Abb. 3a, b). Der Anstieg der Bakterienreplikation wurde nur während der Infektion mit Mtb WT beobachtet, da sowohl die Mtb-ΔesxBA- als auch die ΔcpsA-Mutanten im ATG7-KO-iPSDM eingeschränkt waren (Abb. 2c – f). Wie erwartet kam es nach der Infektion von ATG7 KO iPSDM mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA zu keiner Induktion der LC3B-Verarbeitung (Extended Data Abb. 3c). Die p62-Spiegel in ATG7 KO iPSDM waren bei Mtb WT und ΔcpsA höher als bei WT iPSDM, möglicherweise aufgrund einer Hochregulierung der Transkription (Extended Data, Abb. 3c). Die Einschränkung von Mtb ΔcpsA in iPSDM war nicht mit der Lokalisierung der NADPH-Oxidase verbunden, da nach 2 Stunden Infektion keine Unterschiede in der Rekrutierung von p40 Phox für Mtb WT und ΔcpsA beobachtet wurden (Extended Data Abb. 4). Allerdings war 48 Stunden nach der Infektion das Ausmaß der Assoziation von p40 Phox mit Mtb ΔcpsA im Vergleich zu Mtb WT bei infiziertem iPSDM höher. Während der Analyse stellten wir fest, dass es bei dem mit Mtb WT infizierten ATG7-KO-iPSDM zu einer Verringerung der Gesamtzahl der durch High-Content-Bildgebung analysierten Zellen kam, was auf Zelltod hindeutet, einen Prozess, der mit der Mtb-Replikation in von menschlichen Monozyten abgeleiteten Makrophagen (MDM) verbunden ist )14. Um dies zu testen, haben wir die infizierten Zellen mit NucGreen gefärbt, das selektiv Zellen mit beeinträchtigter Plasmamembranintegrität färbt33. Der Prozentsatz toter Zellen in ATG7 KO iPSDM war nach der Infektion mit Mtb WT signifikant höher, was darauf hinweist, dass die Infektion in ATG7 KO-Zellen mit dem Tod von Makrophagenzellen verbunden war (Abb. 2g, h).

a,c,e, Schnappschuss von lebendem ATG7+/+ und ATG7−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT (a), ΔesxBA (c) und ΔcpsA (e) nach 96 Stunden. Kernfärbung (blau) und Mtb-E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 50 µm. b,d,f, Quantitative High-Content-Analyse der Mtb-Replikation nach Infektion von ATG7+/+ oder ATG7−/− iPSDM mit Mtb WT (b), ΔesxBA (d) und ΔcpsA (f). Die MTB-Fläche pro Zelle wurde als Faltungsänderung relativ zu 2 Stunden nach der Infektion berechnet. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Für Vergleiche wurde ein ungepaarter zweiseitiger t-Test verwendet. **P < 0,002; NS, nicht signifikant. g, Repräsentative Bilder von blau/grün (lebend/tot) gefärbtem ATG7+/+ und ATG7−/− iPSDM, nicht infiziert (CTRL) oder 96 Stunden lang mit Mtb WT infiziert. Kernfärbung (blau) und tote Kernfärbung (grün). Maßstabsbalken, 50 µm. h, Quantitative Analyse des Prozentsatzes der NucGreen-positiven Zellen in jedem Zustand. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, *P < 0,033; NS, nicht signifikant.

Quelldaten

Um den Beitrag von ATG14 zur Mtb-Restriktion zu verstehen, infizierten wir WT und ATG14 KO iPSDM bis zu 96 Stunden lang mit Mtb WT, ΔcpsA oder ΔesxBA und analysierten die Bakterienreplikation durch High-Content-Bildgebung. Die Replikation von Mtb WT war bei ATG14 KO iPSDM im Vergleich zu WT iPSDM nach 96 Stunden signifikant gesteigert (Abb. 3a, b). Ähnlich wie bei den mit Mtb WT infizierten ATG7-KO-iPSDM erlitten die meisten ATG14-KO-iPSDM nach der Mtb-WT-Infektion einen Zelltod, was eine bildbasierte Analyse fester Zellen ausschloss. Im Vergleich zu ATG7-KO-Makrophagen war der Replikations- und Zelltod-Phänotyp bei iPSDM ohne ATG14 jedoch 96 Stunden nach der Infektion stärker ausgeprägt (30 % ATG7 KO gegenüber 50 % beim ATG14 KO-Zelltod nach 96 Stunden Infektion). Dieser Anstieg der Mtb-Replikation stand nicht im Zusammenhang mit Unterschieden in der Phagozytose oder der Bakterienfläche pro Zelle nach der Aufnahme, da beide Parameter in beiden genetischen Hintergründen ähnlich waren (Erweiterte Daten, Abb. 5a, b). Im Gegensatz zu iPSDM ohne ATG7 replizierte der mutierte Mtb ΔesxBA auch im ATG14-KO-iPSDM effizienter (Abb. 3c, d). Im Gegensatz zu Mtb ΔesxBA war die ΔcpsA-Mutante in ATG14 KO iPSDM immer noch eingeschränkt (Abb. 3e, f). Sowohl in nicht infizierten als auch in infizierten Zellen zeigte ATG14 KO iPSDM im Vergleich zu WT iPSDM höhere LC3B-II-Spiegel, was auf einen beeinträchtigten autophagischen Fluss hindeutet (Extended Data Abb. 5c). Die p62-Spiegel in ATG14 KO iPSDM waren unter allen Bedingungen ebenfalls höher als bei WT iPSDM getestet, was die vorherige Beobachtung mit LC3B-II unterstützt (Extended Data Abb. 5c). Der Anstieg der Mtb-WT-Replikation war mit einem Anstieg der Anzahl toter Zellen in ATG14 KO iPSDM verbunden, gemessen durch NucGreen-Färbung, was darauf hindeutet, dass eine verstärkte Bakterienreplikation zum Zelltod von Makrophagen führte. Im Gegensatz dazu wurde der verstärkte Zelltod-Phänotyp weder bei Mtb-ΔesxBA- noch bei ΔcpsA-infiziertem ATG14-KO-iPSDM beobachtet (Abb. 3g, h).

a,c,e, Schnappschuss von lebendem ATG14+/+ und ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT (a), ΔesxBA (c) und ΔcpsA (e) nach 96 Stunden. Kernfärbung (blau) und Mtb-E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 50 µm. b,d,f, Quantitative High-Content-Analyse der Mtb-Replikation nach Infektion von ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM mit Mtb WT (b), ΔesxBA (d) und ΔcpsA (f). Die MTB-Fläche pro Zelle wurde als Faltungsänderung relativ zu 2 Stunden nach der Infektion berechnet. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Für Vergleiche wurde ein ungepaarter zweiseitiger t-Test verwendet. **P < 0,002, *P < 0,033; NS, nicht signifikant. g, Repräsentative Bilder von blau/grün (lebend/tot) gefärbtem ATG14+/+ und ATG14−/− iPSDM, nicht infiziert (CTRL) oder mit Mtb WT, ΔesxBA und ΔcpsA für 96 Stunden infiziert. Kernfärbung (blau) und tote Kernfärbung (grün). Maßstabsbalken, 50 µm. h, Quantitative Analyse des Prozentsatzes der NucGreen-positiven Zellen in jedem Zustand. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zweifaktorielle ANOVA, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, **P < 0,002. Maßstabsbalken, 50 µm.

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Um zu bestimmen, ob die ATG14-KO-iPSDM aufgrund einer hohen Bakterienbelastung absterben oder ob sie nach dem Zelltod für die Mtb-Replikation toleranter werden, führten wir eine High-Content-Live-Cell-Bildgebung von mit Mtb-WT infizierten iPSDM in Gegenwart von Propidiumiodid (PI) durch ), eine Sonde für den Verlust der Plasmamembranintegrität14. Ähnlich wie wir 96 Stunden nach der Infektion beobachteten (Abb. 3g, h), war der Anteil von PI-positivem iPSDM ohne ATG14 sechsmal höher als bei WT-iPSDM (Abb. 4a – d und Zusatzfilm 1). Der Zelltod nahm nach 72 Stunden Infektion in ATG14 KO iPSDM exponentiell zu, was mit einer hohen Bakterienlast korrelierte (Abb. 4c, d und Zusatzfilm 1). Während die Mtb-Replikation bei ATG14 KO iPSDM ab 48 Stunden höher war, wurde der Anstieg des Zelltods erst ab 72 Stunden beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine verstärkte Mtb-Replikation dem Zelltod vorausgeht. Wir beobachteten, dass die Mehrheit der ATG14-defizienten Makrophagen mit hoher Bakterienlast ihre Plasmamembranintegrität verlor und PI-positiv wurde. Die Bakterienreplikation setzte sich fort, nachdem die Zellen undicht geworden waren, und die meisten Zellen mit erhöhter Bakterienlast wurden beeinträchtigt. Die quantitative Analyse der Bakterienreplikation ergab einen deutlichen Unterschied zwischen WT und ATG14 KO iPSDM. Die fache Änderung der Bakterienreplikation war bei ATG14 KO iPSDM achtfach, verglichen mit vierfach bei WT iPSDM (Abb. 4a, c). Dies zeigte, dass die Faltungsänderung beim Live-Snapshot-Ansatz aufgrund des Verlusts stark infizierter Zellen während des Schritts der Lebensfähigkeitsfärbung unterschätzt wurde. Um unsere Ergebnisse zu validieren, haben wir ATG7 und ATG14 in menschlichem MDM unter Verwendung von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex bestehend aus Cas9-Protein und Single Guide RNA (sgRNA) durch Nukleofektion ins Visier genommen34 (Abb. 4e, f). Nach der Infektion mit MDM gab es sowohl bei Mtb-WT (2,6-fach) als auch bei ΔesxBA (0,3-fach) höhere Replikationsraten bei MDM ohne ATG14 (Abb. 4g) als bei WT (Abb. 4h) oder ATG7-defizientem MDM (Abb . 4i). Pool-KO von ATG7 in MDM zeigte nach 5 Tagen der Infektion eine erhöhte Mtb-WT-Replikation (1,1-fach) im Vergleich zu WT-MDM (0,6-fach) (Abb. 4g, i); Dieser Anstieg wurde jedoch für Mtb ΔesxBA nicht beobachtet.

a,c, Quantitative High-Content-Analyse der Live-Mtb-WT-Replikation in ATG14+/+ (a) oder ATG14−/− (c) iPSDM. Die Mtb-Fläche (Punktdiagramm) und der Zelltod (Balkendiagramm) wurden als fache Änderung relativ zur Mtb-Aufnahme zum Zeitpunkt 0 Stunden nach der Infektion berechnet. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten. b,d, Repräsentative mikroskopische Aufnahmen zu den angegebenen Zeitpunkten von ATG14+/+ (b) oder ATG14−/− (d) iPSDM, infiziert mit Mtb WT (grün) in Gegenwart von PI (rot). Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten. Maßstabsbalken, 50 µm. e,f, Western Blot von humanem MDM-Pool-KO für ATG14 (e) oder ATG7 (f). Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten. g, Quantitative High-Content-Analyse der Live-Mtb-WT- und ΔesxBA-Replikation in menschlichem MDM. Die Mtb-Fläche (Punktdiagramm) wurde als fache Änderung im Verhältnis zur Mtb-Aufnahme zum Zeitpunkt 0 Stunden nach der Infektion berechnet. h,i, Quantitative High-Content-Analyse der lebenden Mtb-WT- und Mtb-ΔesxBA-Replikation im nukleofizierten menschlichen MDM-Pool-KO für ATG14 (h) oder ATG7 (i). Die Mtb-Fläche (Punktdiagramm) wurde als fache Änderung im Verhältnis zur Mtb-Aufnahme zum Zeitpunkt 0 Stunden nach der Infektion berechnet. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten.

Quelldaten

Als nächstes konzentrierten wir uns darauf, zu verstehen, ob die erhöhte Replikation von Mtb WT auf einen verbesserten zytosolischen Zugang zurückzuführen war. Um dies zu testen, verwendeten wir Galectin-3 (Gal3) als Marker, der dafür bekannt ist, luminale Glykane beschädigter Phagosomenmembranen zu erkennen. Der Prozentsatz des Mtb-WT, der mit Gal3 in ATG7 KO iPSDM assoziiert ist, unterschied sich nicht vom WT iPSDM (Erweiterte Daten, Abb. 6a, b). Eine klare Assoziation von Gal3 mit Mtb WT und ΔcpsA wurde sowohl bei WT als auch bei ATG7 KO iPSDM beobachtet, während sie bei Mtb ΔesxBA fast nicht vorhanden war (Extended Data Abb. 6a, b). Der Prozentsatz der Gal3-positiven Phagosomen, die Mtb WT und ΔcpsA enthielten, war 2 Stunden nach der Infektion bei iPSDM mit ATG14-Mangel höher als bei WT-iPSDM (Abb. 5a, b). Dieser Effekt wurde in den frühen Stadien der Infektion beobachtet, was darauf hindeutet, dass ATG14 den frühen Zugang von Mtb zum Zytosol reguliert. Wie erwartet waren die Spiegel an Gal3-positivem Mtb-ΔesxBA sowohl bei WT- als auch bei ATG14-KO-iPSDM niedriger und es gab keine Unterschiede zwischen den iPSDM-Genotypen für ΔcpsA zu späteren Zeitpunkten nach der Infektion (Abb. 5a, b). Anschließend analysierten wir die Entstehung von LC3-TVS, die eine Folge von Mtb-induzierten Membranschäden sind22. In Übereinstimmung mit den Gal3-Assoziationsergebnissen war der Prozentsatz der LC3-TVS-positiven Mtb-WT bei ATG14-KO-iPSDM signifikant höher, was darauf hindeutet, dass der Anteil beschädigter Mtb-Phagosomen höher war (Abb. 5c). Wie erwartet wurde dieser Effekt auch bei Mtb-ΔcpsA-Mutanten beobachtet, jedoch nicht bei Mtb-ΔesxBA-infizierten Zellen, was die Rolle des ESX-1-Sekretionssystems bestätigt (Abb. 5c). In diesen Zellen gab es keine Unterschiede in der LC3B-Rekrutierung für Mtb (Abb. 5d). Um diese Beobachtungen auf ultrastruktureller Ebene zu bestätigen, analysierten wir die Bakterienlokalisierung mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Die stereologische Analyse zytosolischer Bakterien bestätigte außerdem, dass 48 Stunden nach der Infektion ein höherer Anteil an Mtb-WT im Zytosol von ATG14-defizientem iPSDM lokalisiert war (Abb. 5e). In WT- und ATG14-KO-Makrophagen war die überwiegende Mehrheit von ΔesxBA in Phagosomen lokalisiert. Anders als bei WT-Zellen befand sich jedoch bei ATG14 iPSDM ein kleiner Anteil von ΔesxBA im Zytosol, was wahrscheinlich auf die Kombination aus hohen Bakterienkonzentrationen und der berichteten Wirkung von PDIM auf die Schädigung der Phagosomenmembran zurückzuführen ist17,18,35,36.

a, GAL3-Färbung in ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA. Kernfärbung (blau), GAL3 (grün) und Mtb E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 10 µm. B. Zusammengestellte Daten aus drei unabhängigen Experimenten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, nicht signifikant. c,d, LC3B-Färbung (oben) und Quantifizierung (unten) von ATG14+/+- oder ATG14−/−-iPSDMs, die mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA infiziert waren, 2 Stunden nach der Infektion. Mtb in TVS-LC3B-positiven (c) oder LC3B-positiven Kompartimenten (d). Kernfärbung (blau), LC3B (grün) und Mtb E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 10 µm. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 5 unabhängige Felder). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, nicht signifikant. e, Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Mtb WT oder ΔesxBA an bestimmten subzellulären Stellen in ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDMs nach 48 Stunden Infektion (links) und stereologische Quantifizierung der subzellulären Verteilung von Mtb WT und ΔesxBA aus TEM-Bildern (rechts) . Zusammengestellte Daten aus zwei unabhängigen Experimenten. Maßstabsbalken, 500 nm.

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Die vorherigen Ergebnisse lieferten eine Erklärung für das äußerst freizügige Verhalten von ATG14 KO iPSDM gegenüber Mtb WT. Allerdings war die höhere Replikationsrate von Mtb ΔesxBA, das keinen effizienten Zugang zum Zytosol hat, unerwartet. Darüber hinaus deuten die TEM-Ergebnisse auf eine permissive intraphagosomale Umgebung für die Replikation von Mtb ΔesxBA hin. Um dies weiter zu untersuchen, analysierten wir Mtb, die während der Infektion mit der sauren Organellensonde LysoTracker (LTR) assoziiert sind, und quantifizierten die mittlere Intensität von LTR als Maß für die Phagosomenreifung. Nach 2 Stunden Infektion war die mittlere LTR-Intensität sowohl für Mtb WT als auch für ΔesxBA in ATG14 KO-infiziertem iPSDM niedriger (Abb. 6a, b). Die LTR-Assoziation blieb für Mtb WT und ΔesxBA in ATG14 KO iPSDM auch nach 24 Stunden Infektion niedriger (Abb. 6a, b). In Übereinstimmung mit den Replikationsergebnissen bei ATG7 KO iPSDM beobachteten wir keine signifikanten Unterschiede in der LTR-Intensität im Zusammenhang mit Mtb WT oder ΔesxBA bei WT im Vergleich zu ATG7 KO iPSDM (Erweiterte Daten, Abb. 6c, d). Angesichts der Tatsache, dass Mtb ΔesxBA hauptsächlich in Phagosomen vorkommt, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ATG14 für die Reifung von Mtb-Phagosomen erforderlich ist. Um diese Beobachtungen zu bestätigen, haben wir einen dualen Reporterstamm generiert, der auf den pH-Wert und die Chloridkonzentration der Umgebung reagiert (rv2390::mWasabi,pMSP12::E2Crimson)37. Der Reporter enthält den konstitutiven Promotor pMSP12, der die Expression von E2-Crimson steuert, und den Promotor von rv2390, der die Expression von mWasabi als Reaktion auf steigende Konzentrationen von Chlorid [Cl−] und sinkenden pH-Wert im Phagosom steuert, die Indikatoren für die Reifung des Phagosoms sind37. Als das Verhältnis von mWasabi/E2-Crimson in infiziertem iPSDM analysiert wurde, stellten wir fest, dass die Aktivität des Promotors, der auf pH-Wert und Chlorid reagierte, bis zu 48 Stunden signifikant anstieg (Abb. 6c, d), wie zuvor bei Mausmakrophagen berichtet . Im Gegensatz dazu blieb bei ATG14 KO iPSDM die Aktivität des Promotors auch nach 48 Stunden Infektion niedrig (Abb. 6c, d). Die Hemmung der V-ATPase-abhängigen Ansäuerung von Mtb-Phagosomen mit Bafilomycin A1 (BAF) beeinträchtigte die Aktivität des rv2390-Promotors sowohl im WT- als auch im ATG14-KO-iPSDM (Abb. 6c, d).

a, Schnappschuss von lebendem ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT und ΔesxBA, gefärbt mit LTR und NucBlue-Farbstoff. Kernfärbung (blau), LTR (grün) und Mtb E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken, 10 µm. b, Quantitative Analyse der LTR-Assoziation mit Mtb als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI). Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, **P < 0,002, *P < 0,033. c, Schnappschuss von ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb, das rv2390::mWasabi,pMSP12::E2-Crimson Reporter in Gegenwart oder Abwesenheit von BafA1 (BAF) exprimiert. Maßstabsbalken. 10 µm. d, Quantitative Analyse der rv2390-Promotoraktivität als MFI von mWasabi gegenüber E2-Crimson zu den angegebenen Zeitpunkten der Infektion mit ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM. Daten repräsentativ für eines von drei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, nicht signifikant. e, Schnappschuss von ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT-, ΔesxBA- oder ΔcpsA-Stämmen, die rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson-Reporter exprimieren, 48 Stunden nach der Infektion. Maßstabsbalken, 10 µm. f, Quantitative Analyse der rv2390-Promotoraktivität als MFI von mWasabi gegenüber E2-Crimson in Mtb WT-, ΔesxBA- oder ΔcpsA-Stämmen zu den angegebenen Zeitpunkten der Infektion mit ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung der Zwei-Wege-ANOVA mit anschließendem Mehrfachvergleichstest nach Šídák angezeigt. ***P < 0,001; NS, nicht signifikant.

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Anschließend transformierten wir die Mtb-ΔesxBA- und ΔcpsA-Stämme mit demselben Reporter und infizierten iPSDM. Nach der Infektion mit WT iPSDM war die Promotoraktivität in Mtb ΔesxBA signifikant höher als in Mtb WT (Abb. 6e, f). Im Gegensatz dazu war die Mtb ΔesxBA rv2390::mWasabi-Reporteraktivität in ATG14 KO iPSDM erheblich reduziert (Abb. 6e, f). Ähnlich wie bei Mtb WT war die rv2390::mWasabi-Reporteraktivität in Mtb ΔcpsA auch in ATG14 KO iPSDM verringert, da sowohl Mtb WT als auch ΔcpsA im Vergleich zu Mtb ΔesxBA weniger einem niedrigen pH-Wert und [Cl−] ausgesetzt waren (Abb. 6e, f). ). Die BAF-Behandlung reduzierte die Reporteraktivität von rv2390::mWasabi unter allen getesteten Bedingungen, was bestätigt, dass die Aktivität des Reporters pH-abhängig war (Extended Data Abb. 6e, f).

Mithilfe einer Kombination aus genetischen und bildgebenden Ansätzen zeigen wir, dass menschliche Makrophagen mit Autophagiedefizienz entscheidende Defekte bei der Mtb-Kontrolle aufweisen. Unser menschliches Makrophagenmodell bietet ein Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Autophagie während einer Mtb-Infektion. Es wurde berichtet, dass eine Störung des Autophagie-Signalwegs durch Gen-Deletion-Ansätze die Mtb-Replikation in Mausmakrophagen in vitro erheblich erhöht23,24,25, und die in diesem Artikel präsentierten Daten liefern genetische Beweise dafür, dass dies zumindest für ATG7 und ATG14 auch der Fall ist Dies ist bei menschlichen Makrophagen der Fall.

Von den sechs in Mausmodellen untersuchten Atg-Proteinen hat nur Atg5 einen wesentlichen Einfluss auf die WT-Mtb-Infektion in vivo, gemessen an koloniebildenden Einheiten, Entzündung und Überleben26,38. Die beobachtete In-vivo-Pathologie ist jedoch hauptsächlich auf eine erhöhte neutrophile Entzündung und eine autophagieunabhängige Funktion von Atg5 zurückzuführen, und zwar über einen ungeklärten Mechanismus26,38. Eines der Argumente zur Erklärung dieser bisher widersprüchlichen Ergebnisse ist, dass die Unterschiede in der Replikation in vitro nicht groß sind und daher nicht direkt in In-vivo-Umgebungen übertragen werden können. Obwohl unklar ist, ob eine große Anzahl von Bakterien in Geweben im Zusammenhang mit menschlichem TB39 relevant ist, beobachteten wir in unseren Experimenten mit menschlichen Makrophagen, denen die Autophagie-Gene ATG7 und ATG14 fehlten, dass die Zellen für Mtb sehr tolerant waren und mit ausgedehnten nekrotischen Zellen assoziiert waren Tod. Mausmakrophagen produzieren in der Lunge hohe Mengen an Stickstoffmonoxid (NO), das für die Kontrolle von Tuberkulose in vivo entscheidend ist40, und hohe NO-Werte könnten einige der autophagieabhängigen Effekte maskieren. Darüber hinaus sind die Cre-lox-Rekombinationssysteme, die bei Mäusen für bedingte KOs verwendet werden, nicht zu 100 % effizient und es könnte eine gewisse Restautophagie vorhanden sein41. Wichtig ist, dass in verschiedenen Kontexten ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Autophagie und Zelltod besteht und die in vivo bedingte Löschung kritischer Autophagie-Gene in bestimmten Zelltypen das Überleben dieser Zellen in vivo beeinträchtigen und gezielt Zellpopulationen dezimieren könnte. Bisher wurden die In-vivo-Modelle zur Untersuchung der Autophagie bei C57BL/6-Mäusen verwendet, die gegen Tuberkulose resistent sind, und es wäre wichtig, die Rolle der Autophagie bei Tuberkulose-anfälligen Mausstämmen wie C3H/HeBFeJ42 oder B6.Sst1S-Mäusen zu untersuchen43 die nekrotische Läsionen aufweisen, die eher der menschlichen Tuberkulose ähneln.

Unsere Daten zeigen, dass die ATG7- und ATG14-abhängige Einschränkung und Induktion des Zelltods hauptsächlich mit einer Mtb-WT-Infektion verbunden ist. Unsere Daten stützen die Annahme, dass sowohl ATG7 als auch ATG14 die Replikation zytosolischer Bakterien kontrollieren, indem sie entweder Bakterien aus dem Zytosol zurückgewinnen22 oder beschädigte Phagosomen durch Autophagosomen versiegeln, wie für Salmonella berichtet44. Der Mtb-ΔcpsA-Mutant ist in der Lage, die Phagosomenmembran zu schädigen, es ist jedoch möglich, dass die Abschwächung in früheren Phasen der Infektion auftritt oder dass der Mtb-ΔcpsA-Mutant aufgrund unbekannter Defekte, beispielsweise bei der Nährstoffaufnahme, nicht in der Lage ist, sich effizient im Zytosol zu replizieren .

Unsere genetischen KO-Experimente legen nahe, dass für die Kontrolle des mutierten Mtb-ΔcpsA in menschlichen Makrophagen weder kanonische noch nicht-kanonische Autophagie erforderlich ist. Atg7-KO-Mausmakrophagen konnten Mtb ΔcpsA bis zu 72 Stunden nach der Infektion nicht einschränken12. Bei iPSDM zeigte Mtb ΔcpsA jedoch eine abgeschwächte Replikation sowohl im ATG7-KO, dem sowohl die kanonische als auch die nicht-kanonische Autophagie fehlt, als auch im ATG14-KO-Makrophagen, das die kanonische, aber nicht die nicht-kanonische Autophagie beeinträchtigt. In Mausmakrophagen wurde gezeigt, dass die Abschwächung der Mtb-CpsA-KO-Mutante auf eine erhöhte NADPH-Oxidase-Rekrutierung und phagosomale ROS-Produktion zurückzuführen ist, die zu LAP führt. Anders als die Ergebnisse bei primären Mausmakrophagen rekrutierte Mtb ΔcpsA in iPSDM NADPH-Oxidase in ähnlichen Mengen wie Mtb WT 2 Stunden nach der Infektion. Diese Diskrepanz könnte auf Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen Makrophagen, Differenzierungsprotokollen und dem genetischen Hintergrund der verwendeten Mtb-Elternstämme zurückzuführen sein. Die in dieser Studie verwendeten Stämme stammen alle vom gleichen Elternstamm ab und wurden auf PDIM-Status getestet, sodass wir die phänotypischen Ergebnisse während der Infektion direkt vergleichen können. In diesem Zusammenhang sind weitere Studien und die Charakterisierung seiner Lokalisierung erforderlich, um den genauen Mechanismus zu definieren, durch den die Mtb-ΔcpsA-Mutante in menschlichen Makrophagen eingeschränkt wird.

Wir schlagen vor, dass ATG7 und ATG14 in verschiedenen Stadien des intrazellulären Lebensstils von Mtb in menschlichen Makrophagen wirken. Während die ATG7-KO-Makrophagen eine signifikante Veränderung der Mtb-WT-Replikation und des Mtb-induzierten Zelltods zeigten, führte der KO von ATG14, der nur die kanonische Autophagie stört, die nicht-kanonische Autophagie jedoch intakt lässt, zu einer ausgeprägteren erhöhten Replikation von Mtb-WT und der Mutante MTB ΔesxBA. Es gibt Hinweise darauf, dass ATG14 die Fusion zwischen Autophagosomen und Lysosomen reguliert45 und auch eine Funktion im endosomalen Signalweg hat, die unabhängig von der Autophagie ist46. Wir fanden heraus, dass ATG14 auch die Fusion zwischen Mtb-haltigen Phagosomen und Lysosomen in Makrophagen reguliert, die Mechanismen, die diesen Prozess regulieren, müssen jedoch weiter untersucht werden. Unsere Ergebnisse werfen Fragen zu möglichen Zusammenhängen zwischen der Phagosomenreifung und dem zytosolischen Zugang auf, wie in Dyctiostelium21 gezeigt. Ist eine verminderte Phagosomenreifung eine Folge einer verstärkten Membranschädigung? Oder führt eine verringerte Phagosomenreifung zu einer verstärkten Membranschädigung und einem erhöhten zytosolischen Zugang? Weitere Studien werden klären, wie diese Ereignisse zeitlich reguliert werden.

Insgesamt zeigten unsere Daten, dass ATG7 und ATG14 zur Kontrolle der Mtb-Infektion durch Makrophagen erforderlich sind, was zeigt, dass Autophagieproteine ​​verschiedene Stadien regulieren: ATG7 und ATG14 regulieren die Kontrolle von zytosolischem Mtb und ATG14 zusätzlich zur Fusion von Mtb-Phagosomen mit Lysosomen. Das Verständnis, wie Autophagie die Infektion intrazellulärer Krankheitserreger beim Menschen kontrolliert, wird die Entwicklung wirtsgesteuerter Therapien ermöglichen.

Mtb H37Rv (Mtb WT) wurde von Prof. Douglas Young (The Francis Crick Institute, UK) bereitgestellt. Mtb-Deletionsmutanten für cpsA (rv3484) oder esxB und esxA (rv3874 und rv3875) wurden mit ORBIT47 konstruiert. Für jeden Mutanten wurden die Transformanten durch PCR (Ergänzungstabelle 1) verifiziert und durch Sequenzierung des gesamten Genoms bestätigt. Die Komplementierung der cpsA-Gen-Deletion erfolgte durch die Expression des Mtb H37Rv cpsA-Gens unter der Kontrolle des hsp60-Promotors von der MS6-Stelle im Chromosom. Die Komplementierung der Deletion der esxBA-Gene wurde erreicht, indem sowohl die Mtb H37Rv-esxB- als auch die esxA-Expression unter die Kontrolle des Psmyc-Promotors30 von der MS6-Stelle im Chromosom gestellt wurden. Fluoreszierende Stämme wurden so konstruiert, dass sie E2-Crimson aus pTEC19 exprimieren (Addgen #30178, von Prof. Lalita Ramakrishnan). Die dualen Reporterstämme von Mtb wurden durch episomale Expression von E2-Crimson aus demselben konstitutiven Promotor wie in pTEC19 konstruiert, und das aus dem pTEC15-Vektor amplifizierte mWasabi-Gen (Addgen #30174, von Prof. Lalita Ramakrishnan) wurde unter die Kontrolle des Chlorids gestellt - und auf einen niedrigen pH-Wert reagierender rv2390c-Promotor37,48. Mtb-Stämme wurden in Middlebrook 7H9 (Sigma-Aldrich, M0178) kultiviert, ergänzt mit 0,2 % Glycerin (Fisher Chemical, G/0650/17), 0,05 % Tween-80 (Sigma-Aldrich, P1754) und 10 % ADC (BD Biosciences, 212352). Geeignete Selektionsmarker 50 µg ml-1 Hygromycin (Invitrogen, 10687010), 25 µg ml-1 Kanamycin (Sigma-Aldrich, K1876) oder 25 µg ml-1 Zeocin (Invivogen, ant-zn-05) wurden bei Bedarf verwendet.

Dreißig Milliliter einer Mykobakterienkultur in der logarithmischen Phase wurden 5 Minuten lang bei 2.000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und zweimal mit einem 0,22-µm-Filter filtriert. Das Pellet wurde mit Waschpuffer (PBS-Tween-80 0,05 % oder PBS-Tyloxapol 0,05 %) und dann mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde in 500 µl PBS mit Proteaseinhibitor resuspendiert und in ein 2-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss, das zu einem Drittel mit Glasperlen (Sigma, G-1145) gefüllt war, überführt. Die Proben wurden 30 Sekunden lang bei einer Einstellung von 6,5 ribolysiert, dann 5 Minuten lang auf Eis gelegt und zweimal 1 Minute lang bei 4 °C und 4.000 g zentrifugiert. Der verbleibende Überstand wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 4.000 g zentrifugiert und 500 μl in ein Millipore Ultrafree-MC-Zentrifugalfiltergerät überführt. Die Proben wurden zweimal mit dem Millipore Ultrafree-MC Zentrifugalfiltergerät bei 4.000 g für 5 Minuten bei 4 °C filtriert.

Menschliche EIKA2- und KOLF2-iPSCs wurden von Public Health England Culture Collections (Katalognummern 77650059 bzw. 77650100) bezogen und in mit Vitronectin XF (StemCell Technologies, 100–0763) beschichteten Platten mit Essential 8-Medium (Gibco, A1517001) aufbewahrt. Die Zellen wurden durch STR-Profiling authentifiziert und monatlich auf Mykoplasmenkontamination überprüft. Die Zellen wurden mit Versene (Gibco, 15040066) passagiert. Monozytenfabriken wurden nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll eingerichtet32. Embryonale Körper (EBs) wurden täglich mit zweimal 50 % Mediumwechsel mit E8 gefüttert, ergänzt mit 50 ng ml–1 hBMP4 (Peprotech, 120–05), 50 ng ml–1 hVEGF (Peprotech, 100–20) und 20 ng ml −1 hSCF (Peprotech, 300-07) für 3 Tage. Am 4. Tag wurden die EBs gesammelt und mit 100–150 EBs pro T175- oder 250–300 pro T225-Kolben in XVIVO-Werksmedium oder OXM-Werksmedium ausgesät (Ergänzungstabelle 2). Diese Monozytenfabriken wurden 5 Wochen lang wöchentlich gefüttert, bis Monozyten im Überstand beobachtet wurden. Bis zu 50 % des Überstands wurden wöchentlich gesammelt und 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Die Zellen wurden in XVIVO-Differenzierungsmedium oder OXM-Differenzierungsmedium resuspendiert (Ergänzungstabelle 2). Monozyten wurden mit 4 × 106 Zellen pro 10 cm Petrischale ausplattiert, um über 7 Tage zu differenzieren; Am 4. Tag wurde ein 50-prozentiger Mediumwechsel durchgeführt. Zur Ablösung wurden die Zellen einmal mit PBS (pH 7,4) gewaschen, dann 15 Minuten lang mit Versene bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor sie 1:3 mit PBS verdünnt und vorsichtig abgekratzt wurden. Makrophagen wurden bei 300 g zentrifugiert und für Experimente ausplattiert.

Zehn Milliliter logarithmische Kultur wurden 2 Stunden lang bei 95 °C in 1 ml PBS inaktiviert. Nach drei Wäschen in Wasser wurden die Überstände aus aufeinanderfolgenden Inkubationen in Chloroform:Methanol (2:1) und Methanol:Chloroform (1:1) gepoolt und bei 55 °C getrocknet. Getrocknete Lipide wurden weiter in Chloroform resuspendiert, auf einer Kieselgelplatte mit einem Lösungsmittelgemisch aus Petrolether:Ethylacetat (98:2) aufgelöst und mit 5 % Phosphomolybdänsäure in Ethanol gegen gereinigte PDIMs (H37Rv, Purified Phthiocerol Dimycocerosate, BEI Resources, NR-20328) und ein Stamm mit Defekt in der PDIM-Synthese49 als Positiv- bzw. Negativkontrolle.

Die CRISPR-Cas9-basierte KO-Strategie nutzte vier sgRNAs, die spezifische Gen-Exons flankieren, um eine Deletion einer Genomsequenz zu erreichen. Die sgRNAs, die auf ATG7 und ATG14 abzielen, wurden mit dem WGE CRISPR-Designtool (www.sanger.ac.uk/htgt/wge/)50 entworfen und ausgewählt. Die Nukleofektion von EIKA2-iPSCs wurde unter Verwendung des Amaxa 4D-Nukleofektors (V4XP-3024, Lonza) durchgeführt, um ATG7-KO-Klone zu erhalten. ATG7-KO-iPSC waren lebensfähig und zeigten keinen Replikationsmangel, obwohl die Schritte der EB-Bildung und der Monozytenproduktion unterschiedlich waren. Für jede Nukleofektion wurden 1 × 106 menschliche iPSCs in 100 µl P3-Puffer (Lonza, V4XP-3024) resuspendiert, der 20 µg Sp Cas9 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3, 1081059, IDT) enthielt, gemischt mit insgesamt 16 µg synthetisch chemisch modifizierte Single Guide RNAs (Synthego) (Ergänzungstabelle 3). Die Zellen und der Cas9-RNP-Mix wurden dann mit dem Programm CA-137 nukleofiziert. Nach der Nukleofektion wurden einzelne Klone manuell ausgewählt51 und mittels PCR-basiertem Assay gescreent (Sequenzen siehe Ergänzungstabelle 1). Die Nukleofektion von KOLF2-iPSCs zur Gewinnung von ATG14-KO- und ATG7-KO-Klonen wurde wie oben durchgeführt.

Die Zellen wurden gesammelt und in PBS/0,1 % BSA (Cell Signaling Technologies, 9998S) und 5 µl Fc-Block pro Million Zellen 20 Minuten lang inkubiert. Fünfzig Mikroliter Zellen wurden mit 50 µl Antikörpercocktail, verdünnt in PBS/0,1 % BSA, 20 Minuten lang auf Eis im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden in 2 ml PBS gewaschen und in 2 % Paraformaldehyd (PFA; Electron Microscopy Sciences, 15710) fixiert. Die Zellen wurden auf einem LSRII-Durchflusszytometer analysiert. Die Antikörper wurden von BD Biosciences gekauft und sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Die Durchflusszytometriedaten wurden in FlowJo (BD Biosciences) analysiert und aufgezeichnet.

iPSDM wurden mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well einer 96-Well-Platte, 150.000 Zellen pro Well einer 24-Well-Platte, 500.000 Zellen pro Well einer 12-Well-Platte und 1 × 106 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte ausgesät. Brunnenplatte. Bakterienkulturen in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 0,5–1,0) wurden 5 Minuten lang bei 2.000 g zentrifugiert und zweimal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Pellets 1 Minute lang kräftig mit 2,5–3,5 mm großen Glasperlen (VWR, 332124 G) geschüttelt und die Bakterien in 10 ml Makrophagen-Kulturmedium resuspendiert, bevor sie 5 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert wurden, um große Klumpen zu entfernen. Die obersten 7 ml der Bakteriensuspension wurden entnommen, der OD600-Wert aufgezeichnet und die Suspension entsprechend einer Infektion verdünnt. Nach zweistündiger Aufnahme wurden die extrazellulären Bakterien durch zwei Wäschen in PBS entfernt und die Makrophagen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Zum erforderlichen Zeitpunkt nach der Infektion wurden die Zellen gesammelt oder in 4 % PFA fixiert. Für alle Experimente wurde eine angestrebte Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 verwendet, wobei davon ausgegangen wurde, dass die OD600 von 1 1 × 108 Bakterien ml−1 beträgt. Die Behandlung mit Bafilomycin A1 erfolgte parallel zur Infektion mit einer Endkonzentration von 100 nM und blieb bis zum letzten Zeitpunkt bestehen.

Die Zellen wurden aus Leukozytenkegeln (NC24) hergestellt, die vom NHS Blood and Transplant Service14 bereitgestellt wurden. Weiße Blutkörperchen wurden durch 60-minütige Zentrifugation auf Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, 17-5442-03) bei 300 g isoliert. Mononukleäre Zellen wurden gesammelt und zweimal mit MACS-Spüllösung (Miltenyi, 130-091-222) gewaschen, um Blutplättchen und rote Blutkörperchen zu entfernen. Die restlichen Proben wurden mit 10 ml RBC-Lysepuffer (Sigma, R7757) pro Pellet 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit Spülpuffer gewaschen und in 80 µl MACS-Spüllösung, ergänzt mit 1 % BSA (Miltenyi, 130-091-376) (MACS/BSA) und 20 µl Anti-CD14-Magnetkügelchen (Miltenyi, 130-050-201), resuspendiert ) pro 108 Zellen. Nach 20 Minuten auf Eis wurden die Zellen in MACS/BSA-Lösung gewaschen und bei einer Konzentration von 108 Zellen pro 500 µl in MACS/BSA-Lösung resuspendiert und weiter durch eine LS-Säule (Miltenyi, 130-042-401) im Feld geleitet ein QuadroMACS-Trennmagnet (Miltenyi, 130-090-976). Die LS-Säule wurde dreimal mit MACS/BSA-Lösung gewaschen, dann wurden CD14-positive Zellen eluiert, zentrifugiert und in vollständigem RPMI 1640 mit GlutaMAX und HEPES (Gibco, 72400-02) und 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Sigma, F7524).

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in der geeigneten primären Nukleofektionslösung (Amaxa Human Monocyte Nucleofector Kit, Kat.-Nr. VPA-1007) unter Verwendung des Lonza 2b Nucleofector (Nucleofector 2b Device, AAB-1001) elektroporiert. Pro Reaktion wurden insgesamt 5 × 106 Zellen verwendet und in 100 µl primärer Nukleofektionslösung resuspendiert, die 4 µg Sp Cas9 (IDT) enthielt, gemischt mit insgesamt 12 µg zielgerichteter synthetischer, chemisch modifizierter Single Guide RNAs (Synthego) (Ergänzung). Tisch 3). MDM wurden dann mit dem sgRNA-Pool und dem Cas9-RNP-Mix unter Verwendung des Y001-Programms nukleofiziert. Nukleofezierte Zellen wurden in vorgewärmtem RPMI 1640, ergänzt mit GlutaMAX, HEPES und 10 % FBS, in einer Platte mit sechs Vertiefungen kultiviert. Zwei Stunden nach der Nukleofektion wurden den Zellen 100 ng ml-1 hM-CSF zugesetzt. Die Schalen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 3 Tagen wurde ein gleiches Volumen frisches Komplettmedium einschließlich 100 ng ml−1 hM-CSF hinzugefügt. Nach 6 Tagen wurden differenzierte Makrophagen in 0,5 mM EDTA in eiskaltem PBS unter Verwendung von Zellschabern (Sarsted, 83.1830) abgelöst, durch Zentrifugation pelletiert und in RPMI-Medium mit 10 % FBS34 resuspendiert.

Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, auf Eis in RIPA-Puffer (Millipore, 20–188), der vollständigen, EDTA-freien Proteaseinhibitor (Thermo Fisher Scientific, 78445) enthielt, lysiert und 20 Minuten lang bei 95–100 °C in einer LDS-Probe gekocht ( Thermo Fisher Scientific, NP008) und NuPage Sample Reducing Agent (Thermo Fisher Scientific, NP009). Die Proben wurden in 4–12 % Bis-Tris-Gel (Thermo Fisher Scientific, WG1403BOX) geladen und die Elektrophorese wurde 120 Minuten lang bei 100 V durchgeführt. Die Gele wurden mit einem iBlot2 (Thermo Fisher Scientific, IB21001) und Programm P0 auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden in 5 % Magermilchpulver in TBS plus 0,05 % Tween20 (TBS-T) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert und dann mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Membranen wurden in TBS-T gewaschen und mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Membranen wurden mit einem verstärkten Chemilumineszenzreagenz (Bio-Rad) entwickelt und auf einem Amersham GE Imager 680 (GE Healthcare) abgebildet. Die Molekulargewichtsleiter stammte von Abcam (116028).

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, dann 2 Stunden lang in Vollmedium inkubiert oder mit Hanks' Balanced Salt Solution (Thermo Fisher Scientific, 14170088) mit oder ohne 100 nM Bafilomycin A1 (Merck, B1793-10UG) oder 50 µM von Aminosäuren befreit Monensin (Sigma Aldrich, M5273-5G). Die verwendeten Antikörper waren p62 (5114), Atg7 (8558), Atg14 (5504 S), β-Actin-HRP (12262) von Cell Signaling Technologies, LC3B (ab48394), Anti-ESAT6 (EsxA, ab26246), Anti-CFP10 ( EsxB, ab45074) und Anti-Ag85 (ab36731) von Abcam sowie Anti-Kaninchen-IgG konjugiert an HRP (W4011) und Anti-Maus-IgG konjugiert an HRP (W4021) von Promega.

Die Zellen wurden in 4 % PFA in PBS fixiert, mit 50 mM NH4Cl in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur gequencht und mit 0,3 % Triton X-100, 5 % FBS in PBS für 30 Minuten permeabilisiert. Die Antikörper wurden in PBS mit 5 % FBS verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zwischen den Antikörpern wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen. Die Kerne wurden 10 Minuten lang mit DAPI (ThermoFisher, D1306), verdünnt 1:10.000 in PBS, gefärbt. Deckgläser wurden mit DAKO-Eindeckmedium (DAKO, S3023) auf Objektträger montiert. Die verwendeten Antikörper waren Alexa Fluor 488 Anti-Maus/Mensch-Mac-2 (Galectin-3)-Antikörper (BioLegend, 125410, 1:500), Anti-LC3B (MBL, PM036, 1:100), p40 Phox (Millipore, 07–) 503, 1:100) und Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (Life Technologies, A11034, 1:500).

Deckgläser wurden unter Verwendung eines inversen konfokalen Leica SP8-Mikroskops (Leica Microsystems) mit einem Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur (NA) von 63 × 1,4 abgebildet. Die Fluoreszenz wurde mit HyD-Detektoren nachgewiesen. Die Laser- und Detektoreinstellungen wurden zwischen den Bedingungen für jede biologische Wiederholung eines Experiments konstant gehalten.

Nach 72 oder 96 Stunden Infektion wurden die Zellen 30 Minuten lang mit dem Blue/Green ReadyProbes Cell Viability Imaging Kit (Invitrogen, R37609) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gefärbt. Für die Bildgebung der Zeitpunkte 2, 24 und 48 Stunden nach der Infektion wurde ausschließlich NucBlue ReadyProbes Reagent (Thermo Fisher Scientific, R37605) verwendet. Die Bildgebung lebender Zellen wurde unter Verwendung eines OPERA Phenix-Mikroskops (Perkin Elmer) mit 40 × 1,1 NA-Wasserimmersionsobjektiv mit einer Überlappung von 10 % zwischen benachbarten Feldern und drei Vertiefungen pro Bedingung und Experiment durchgeführt. Segmentierung und Analyse wurden mit der Harmony-Software (Perkin Elmer, Version 4.9) durchgeführt, wobei die maximale Projektion einzelner Z-Ebenen mit einem ungefähren Abstand von 1 µm verwendet wurde, um eine Einzelzellsegmentierung durch Kombination der Funktionen „Kerne suchen“ und „Zellen suchen“ durchzuführen. Bausteine. Zur Quantifizierung der Mtb-Replikation wurden Bakterien mit dem „Find Spots“-Baustein von Harmony erkannt. Um die Bakterienfläche für jede Zelle zu bestimmen, wurde die Spotfläche für jede segmentierte Zelle summiert. Die mittlere Bakterienfläche pro Zelle zu jedem Zeitpunkt und jeder Bedingung wurde in R Studio (The R Project for Statistical Computing, Version 1.3.1073) importiert. Die Ergebnisse wurden dann als .csv-Datei exportiert. Das Mtb-Wachstum als fache Änderung wurde nach der folgenden Formel berechnet: (mittlere Mtb-Fläche pro Zelle zum Zeitpunkt – mittlere Mtb-Fläche pro Zelle bei t2h)/(mittlere Mtb-Fläche pro Zelle bei t2h).

Zur Beurteilung des Zelltods wurden Segmentierung und Analyse mit der Harmony-Software durchgeführt, wobei die maximale Projektion einzelner Z-Ebenen mit einem ungefähren Abstand von 1 µm verwendet wurde, um eine Einzelzellsegmentierung durch den Baustein „Find nuclei“ durchzuführen. Die Gesamtzahl der Kerne wurde berechnet, und dann wurden die Kerne berechnet, die für NucGreen positiv waren, indem ein Schwellenwert für die Intensität von Alexa Fluor 488 festgelegt wurde. Der Prozentsatz des Zelltods wurde bestimmt, indem die Anzahl der grünen Kerne durch die Gesamtzahl der Kerne dividiert wurde.

Insgesamt wurden 50.000 Makrophagen pro Vertiefung auf einer Platte mit 96 Vertiefungen und Olefinboden ausgesät. Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit Mtb bei einer MOI von 1 infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch Medium mit 0,4 µg ml−1 PI (Abcam, ab14083) ersetzt. Die Bildgebung erfolgte mit einem OPERA Phenix-Mikroskop (Perkin Elmer) mit 40× 1,1 NA Wasserimmersionsobjektiv mit einer 10 %igen Überlappung zwischen benachbarten Feldern. Fünf Ebenen mit einem Abstand von 1 µm und mehr als 20 Sichtfeldern wurden über die Zeit überwacht und 96 Stunden lang alle 1,5 Stunden Schnappschüsse gemacht. Zur Beurteilung der Bakterienreplikation und des Zelltods wurde die Analyse mit der Harmony-Software durchgeführt, wobei die maximale Projektion einzelner Z-Ebenen mit einem ungefähren Abstand von 1 µm verwendet wurde. Um eine Zellsegmentierung durchzuführen, wurde der Baustein „Find Texture Regions“ im Brightfield-Kanal trainiert, um Zellbereiche zu segmentieren. Nach der Segmentierung des Zellbereichs wurden die Bausteine ​​„Find Spots“ und „Find Nuclei“ verwendet, um Mtb- und PI-positive Kerne zu segmentieren. Um die Bakterienfläche und die PI-positiven Kerne im Zeitverlauf zu bestimmen, wurden die Spotfläche und die Anzahl der PI-positiven Kerne für jeden Zeitpunkt summiert. Das Mtb-Wachstum als Faltungsänderung wurde nach der folgenden Formel berechnet: (Summe der intrazellulären Mtb-Fläche für den Zeitpunkt – Summe der intrazellulären Mtb-Fläche zum Zeitpunkt t0h)/(Summe der intrazellulären Mtb-Fläche zum Zeitpunkt t0h). Der Zelltod als Faltungsänderung wurde nach der folgenden Formel berechnet: (Summe der PI-positiven Kerne zum Zeitpunkt – Summe der PI-positiven Kerne zum Zeitpunkt t0h)/(Summe der PI-positiven Kerne zum Zeitpunkt t0h).

Die Bilder wurden mit dem Opera Phenix-System aufgenommen. Die Zellen wurden entweder in 96-Well-Viewplates mit Glasboden oder in 96-Well-Platten mit Olefinboden gefärbt und mit einem 63 × 1,15 NA-Wasserimmersionsobjektiv abgebildet. Die Segmentierung wurde mit der Harmony-Software durchgeführt. Das DAPI-Signal einer einzelnen Z-Ebene wurde mithilfe des Bausteins „Find Nuclei“ erkannt, der nächste Baustein „Find Spots“ wurde zur Durchführung der Bakteriensegmentierung verwendet. Die Gal3-Assoziation wurde manuell berechnet; Für jede Bedingung wurden fünf Felder mit über 100 Zellen analysiert. Um die LC3B- und LC3-TVS-Assoziation mit Mtb zu quantifizieren, wurden Bilder mit einem inversen konfokalen Leica SP8-Mikroskop mit einem Ölimmersionsobjektiv mit 63 × 1,4 NA aufgenommen. Die Quantifizierung der Mtb- und LC3-TVS-Assoziation erfolgte manuell mit der Open-Source-Software ImageJ/Fiji v1.53a, und für jede Bedingung wurden fünf Felder mit über 100 Zellen analysiert.

Die Proben wurden durch Zugabe von doppelt starkem Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehyd und 8 % Formaldehyd in 200 mM HEPES, pH 7,4) zum Kulturmedium für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und dann über Nacht durch 1,25 % Glutaraldehyd und 4 % Formaldehyd in 200 mM HEPES ersetzt bei 4 °C. Die Proben wurden in einem Biowave Pro (Pelco) unter Verwendung von Mikrowellenenergie und Vakuum verarbeitet. Kurz gesagt, die Zellen wurden zweimal in HEPES (Sigma-Aldrich H0887) gewaschen und mit einer Mischung aus 2 % Osmiumtetroxid (Taab O011) und 1,5 % Kaliumferricyanid (Taab, P018) (v/v) nachfixiert. Die Proben wurden viermal mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2 % wässrigem Uranylacetat (Agar Scientific AGR1260A) angefärbt und dann wie zuvor gewaschen. Die Proben wurden unter Verwendung einer schrittweisen Ethanolreihe von 50 %, 75 %, 90 % und 100 % dehydriert, dann mit Propylenoxid aus dem Gewebekulturkunststoff herausgehoben, viermal in trockenem Aceton gewaschen und in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Proben wurden mit einer Verdünnungsreihe von 50 %, 75 % und 100 % einer Mischung aus Ultra Bed Low Viscosity Epoxy (EMS)-Epoxidharz (EMS) und Aceton infiltriert und zwischen den Wechseln bei 600 g zentrifugiert. Abschließend wurden die Proben mindestens 48 Stunden lang bei 60 °C ausgehärtet.

Ultradünne Schnitte (~60 nm) wurden mit einem Ultramikrotom EM UC7 (Leica Microsystems) unter Verwendung eines oszillierenden Ultraschall-35°-Diamantmessers (DiaTOME) bei einer Schnittgeschwindigkeit von 0,6 mm s−1, einer im automatischen Modus eingestellten Frequenz und einer Spannung von geschnitten 6,0 V. Die Bilder wurden mit einem 120k 1400FLASH VTEM mit einer Matataki CCD-Kamera aufgenommen.

Stereologische Analyse von Mtb-infizierten Zellen: Mindestens 33 verschiedene infizierte Zellen pro Gruppe wurden durch systematische und zufällige Stichprobenziehung mit 3.900-facher Vergrößerung abgebildet. Die Kreuzungspunkte des stereologischen Testgitters über Bakterien wurden hinsichtlich der subzellulären Lokalisierung von Bakterien gezählt, die anhand von Bildern bestimmt wurde, die bei einer Mindestvergrößerung von 16.000 × aufgenommen wurden. Für die Beurteilung der Beteiligung der subzellulären Membran wurden die folgenden Kriterien befolgt: (1) einzelne umgebende Membran, das heißt, die Bakterien waren zumindest teilweise dicht von einer Phospholipid-Doppelschicht umgeben, die die phagosomale Membran darstellte; (2) zytosolisch, das heißt, die Bakterien waren von Ribosomen umgeben, die das Zytoplasma ohne Anzeichen der phagosomalen Membran darstellten; (3) mehrere umgebende Membranen, das heißt, Bakterien wurden von Doppel- oder Mehrfachmembranstrukturen umhüllt.

Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben mit Mtb WT oder ΔesxBA bei einer MOI von 1 infiziert. Infizierte Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und mit Medium, das 200 nM LysoTracker Green DND-26 (LTR; Invitrogen, L7526) und NucBlue ReadyProbes Reagent (Invitrogen, R37605) enthielt, gemäß den Empfehlungen des Herstellers gefärbt. Segmentierung und Analyse wurden wie oben mit der Harmony-Software durchgeführt. Das DAPI-Signal von einer einzelnen Z-Ebene wurde mithilfe des Bausteins „Find Image Region“ erkannt, anschließend wurde der Baustein „Find Spots“ zur Durchführung der Bakteriensegmentierung verwendet. Jede einzelne interessierende Region wurde in eine Maske umgewandelt und mithilfe des Bausteins „Find Surrounding Regions“ mit einem individuellen Schwellenwert von 0,8 und einschließlich der Eingaberegion erweitert. Diese Maske wurde verwendet, um die mittlere LTR-Intensität zu bestimmen, die jeder Mtb-Region zugeordnet ist. Die mittlere LTR-Intensität für jedes Mtb wurde berechnet und der Mittelwert für jeden Zeitpunkt und jede Bedingung in RStudio importiert. Die Ergebnisse wurden dann als .csv-Datei exportiert.

Die Analyse des Mtb-exprimierenden pH/Chlorid-Reporters (rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson) wurde mit der Harmony-Software durchgeführt. Die Segmentierung und Analyse erfolgte bei maximaler Projektion einzelner Z-Ebenen mit einem ungefähren Abstand von 0,5 µm. Das DAPI-Signal von allen Z-Ebenen wurde mithilfe der Bausteine ​​„Find Nuclei“ und „Find Cytoplasma“ erfasst, um eine genaue Zellsegmentierung durchzuführen. Signale sowohl von mWasabi- als auch von E2-Crimson-Kanälen wurden mithilfe des Bausteins „Find Image Region“ oder alternativ des Bausteins „Find Spot“ erkannt, bei dem ein manueller Schwellenwert angewendet wurde, um bakterielle Objekte genau zu definieren. Die Signale der mWasabi- und E2-Crimson-Kanäle wurden mithilfe der Funktion „Bild berechnen“ und der Funktion „Nach Formel“ durch Anwenden einer Kanal-A + B-Operation zusammengeführt. Für jedes Bakterienobjekt wurde die mittlere Fluoreszenzintensität von mWasabi und E2-Crimson mit dem Baustein „Intensitätseigenschaften berechnen“ bestimmt. Die Reporteraktivität für jedes Bakterienobjekt wurde berechnet, indem eine Formelausgabe der mittleren mWasabi-Intensität pro Objekt über der mittleren E2-Crimson-Intensität pro Objekt generiert wurde. Der Mittelwert jeder Bedingung wurde dann als CSV-Datei exportiert.

Alle Diagramme wurden erstellt und statistische Analysen wurden in GraphPad Prism Version 9.4.0 (GraphPad Software LLC) durchgeführt. Die Abbildungen wurden mit Adobe Illustrator 2022 Version 26.2.1 (Adobe) zusammengestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Alle Analysen wurden reproduzierbar unter Verwendung öffentlich verfügbarer R-Skripte durchgeführt.

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Wir danken der Human Embryonic Stem Cell Unit, der Electron Microscopy STP und der Advanced Light Microscopy STP für ihre Unterstützung in verschiedenen Aspekten der Arbeit. Wir danken C. Bourges und J. Lee (The Francis Crick Institute) für ihre Hilfe bei der Nukleofektion von Primärzellen. Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute (an MGG) unterstützt, das seine Hauptfinanzierung von Cancer Research UK (FC001092), dem UK Medical Research Council (FC001092) und dem Wellcome Trust (FC001092) erhält. Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union gefördert (Fördervereinbarungsnummer 772022). Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben. CB hat Fördermittel von der European Respiratory Society und dem H2020-Forschungs- und Innovationsprogramm der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 713406 erhalten. PS wird durch ein nicht-stipendiatisches FEBS-Langzeitstipendium unterstützt und hat Fördermittel von der Europäischen Union erhalten Forschungs- und Innovationsprogramm H2020 im Rahmen der Marie-Sklodowska-Curie-Fördervereinbarung, SpaTime_AnTB-Nummer 892859.

Elliott M. Bernard

Derzeitige Adresse: Abteilung für Immunbiologie, Universität Lausanne, Epalinges, Schweiz

Pierre Santucci

Derzeitige Adresse: Universität Aix-Marseille, CNRS, LISM, Marseille, Frankreich

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino.

Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen im Tuberkuloselabor, Francis Crick Institute, London, Großbritannien

Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino, Laure Botella, Antony Fearns, Natalia Athanasiadi, Claudio Bussi, Pierre Santucci und Maximiliano G. Gutierrez

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MGG konzipierte das Projekt und war der Hauptbetreuer der Studie. BA, EMB und EP führten Experimente durch und analysierten die Daten. LB hat alle in dieser Arbeit verwendeten MTB-Stämme generiert und charakterisiert. AF führte die elektronenmikroskopische Analyse durch. NA, CB und PS trugen zur Stammzellkultur und Makrophagenproduktion bei. MGG schrieb den ersten Entwurf und BA bereitete die Zahlen vor. BA, EMB und EP haben das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren überarbeitet.

Korrespondenz mit Maximiliano G. Gutierrez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Maziar Divangahi und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Schematische Darstellung der ATG7−/− CRISPR-Strategie. Braune Kreise zeigen die Ausrichtung der PAM-Sequenz und die grünen Linien zeigen die sgRNAs an, die zum Zielen auf die Introns verwendet werden, die das Exon 2 und Exon 3 von ATG7 flankieren. Schwarze Pfeile zeigen den Primer (GF2 und GR2), der zur Genotypisierung der einzelnen Klone nach dem Targeting verwendet wird. b, c, Repräsentativer Western Blot von LC3B, p62 und ATG7 in ATG7+/+, ATG7−/− iPSC (b) und iPSDM (c) nach Hunger in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 nM BafA1, 100 nM BafA1 allein oder 50 µM Monensin für 2 Stunden. d, Schematische Darstellung der Ausrichtung der ATG14−/− CRISPR-Strategie. Braune Kreise zeigen die Ausrichtung der PAM-Sequenz und die grünen Linien zeigen die sgRNAs an, die zum Zielen auf das Intron verwendet werden, das das Exon 5 von ATG14 flankiert. Schwarze Pfeile zeigen die Primer (GF1 und GR1), die zur Genotypisierung der einzelnen Klone nach dem Targeting verwendet wurden. e,f, Repräsentativer Western Blot von LC3B, p62 und ATG14 in ATG14+/+, ATG14−/− iPSC (e) und iPSDM (f) nach Hunger in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 nM BafA1, 100 nM BafA1 allein oder 50 µM Monensin für 2 Stunden. Repräsentative Western Blots von drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3).

Quelldaten

Durchflusszytometrische Charakterisierung von WT-, ATG14- und ATG7-KO-Monozyten und Makrophagen. Die Namen der Marker sind oben in jeder Diagrammspalte angegeben und der Genotyp der Zellen ist am Anfang jeder Zeile angegeben. Rosa stellt die Isotypkontrolle dar und Blau den entsprechenden Marker.

Quelldaten

a, Das linke Diagramm zeigt die quantitative Analyse des Mtb-WT- oder DesxBA-Bereichs in ATG7-/-- oder ATG7+/+-iPSDMs 2 Stunden nach der Infektion. Das rechte Diagramm zeigt den Prozentsatz infizierter Zellen 2, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion aus demselben biologischen Replikat. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. (b) Die Grafik auf der linken Seite stellt die Quantifizierung der Mtb-WT- oder DcpsA-Fläche in ATG7−/− oder ATG7+/+ iPSDMs 2 Stunden nach der Infektion dar. Das rechte Diagramm zeigt den Prozentsatz infizierter Zellen 2, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion aus demselben biologischen Replikat. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. (c) Western-Blot-Analyse der ATG7-, p62- und LC3B-Spiegel in ATG7+/+- und ATG7−/− iPSDMs 2 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA. Repräsentative Western Blots von zwei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 2).

Quelldaten

a, iPSDM wurden 2 h, 24 h und 48 h lang mit Mtb WT, DcpsA oder DcpsA:cpsA infiziert und durch indirekte Immunfluoreszenz auf p40 Phox gefärbt. Repräsentative Bilder der p40-Phox-Rekrutierung für jeden Stamm zu den angegebenen Zeitpunkten. Die Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige biologische Replikate. Maßstabsbalken: 10 µm. b, Quantitative Analyse der p40-Phox-Rekrutierung für WT Mtb, DcpsA oder DcpsA:cpsA. Die Daten sind Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen biologischen Replikaten. Eine einfache ANOVA folgte mit dem Mehrfachvergleichstest von Šídák *p < 0,033, ns = nicht signifikant.

Quelldaten

a, Das linke Diagramm zeigt die quantitative Analyse des Mtb-WT- oder DesxBA-Bereichs in ATG14−/−- oder ATG14+/+ iPSDMs 2 Stunden nach der Infektion. Das rechte Diagramm zeigt den Prozentsatz infizierter Zellen 2, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion aus demselben biologischen Replikat. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. (b) Die Grafik auf der linken Seite stellt die Quantifizierung der Mtb-WT- oder DcpsA-Fläche in ATG14−/− oder ATG14+/+ iPSDMs 2 Stunden nach der Infektion dar. Das rechte Diagramm zeigt den Prozentsatz infizierter Zellen 2, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Infektion aus demselben biologischen Replikat. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. (c) Western-Blot-Analyse der ATG14-, p62- und LC3B-Spiegel in ATG14+/+- und ATG14−/− iPSDMs 2 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion mit Mtb WT, ΔesxBA oder ΔcpsA. Repräsentative Western Blots von drei unabhängigen biologischen Replikaten (n = 3).

Quelldaten

a, Repräsentative Bilder der endogenen Gal-3-Lokalisierung in ATG7+/+ oder ATG7−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT, Mtb ΔesxBA oder Mtb ΔcpsA. Die Bilder zeigen Kernfärbung (blau), GAL3 (grün) und Mtb E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken: 10 µm. b, Manuelle Quantifizierung der Gal-3-Assoziation mit Mtb WT, Mtb ΔesxBA oder Mtb ΔcpsA nach 2 h, 24 h oder 48 h Infektion. Zusammengestellte Daten aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, ns = nicht signifikant. c, Repräsentative Bilder von ATG7+/+ oder ATG7−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT und Mtb ΔesxBA, gefärbt mit LysoTracker und NucBlue-Farbstoff und abgebildet im Live-Modus nach 2 und 24 Stunden Infektion durch High-Content-Bildgebung. Die Bilder zeigen Kernfärbung (blau), LysoTracker (grün) und Mtb E2-Crimson (rot). Maßstabsbalken: 10 µm. d, Quantitative Analyse der LTR-Assoziation mit Mtb als mittlere Fluoreszenzintensität. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Einfaktorielle ANOVA gefolgt vom Mehrfachvergleichstest nach Šídák, ns = nicht signifikant. e, Repräsentative Bilder von ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM, infiziert mit Mtb WT-, ΔesxBA- oder ΔcpsA-Stämmen, die rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson-Reporter in Gegenwart von 100 nM BafA1 exprimieren, 48 Stunden nach der Infektion. f: Die quantitative Analyse der rv2390-Promotoraktivität in Mtb WT-, ΔesxBA- oder ΔcpsA-Stämmen zu den angegebenen Zeitpunkten der Infektion mit ATG14+/+ oder ATG14−/− iPSDM in Gegenwart von 100 nM BafA1 wurde als fache Änderung von mWasabi MFI gegenüber E2 berechnet -Crimson MFI für ein einzelnes bakterielles Ereignis. Daten repräsentativ für eines von zwei unabhängigen Experimenten (n = 3 unabhängige Vertiefungen).

Quelldaten

Legende des Zusatzvideos 1 und der Tabellen 1–4.

Live-Bildgebung der Mtb-Replikation in WT und ATG14 KO iPSDM: Die Bildgebung wurde mit dem OPERA Phenix-Mikroskop mit 40× 1,1 NA Wasserimmersionsobjektiv mit einer 10 %igen Überlappung zwischen benachbarten Feldern durchgeführt. Die maximale Projektion von fünf Ebenen mit einem Abstand von 1 µm aus einem einzelnen Sichtfeld wurde 96 Stunden lang alle 1,5 Stunden überwacht. Für die Bildgebung auf dem Opera Phenix wurde Hellfeld mit λex = Transmission/λem = 650–760 nm, PI (rot) mit λex = 561 nm/λem = 570–630 nm und E2-Crimson Mtb (grün) erkannt unter Verwendung von λex = 640 nm/λem = 650–760 nm unter Verwendung einer 16-Bit-scMOS-Kamera.

Unverarbeitete Western Blots.

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Daten der Durchflusszytometrie.

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Unverarbeitete Western Blots.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aylan, B., Bernard, EM, Pellegrino, E. et al. ATG7 und ATG14 beschränken die zytosolische und phagosomale Replikation von Mycobacterium tuberculosis in menschlichen Makrophagen. Nat Microbiol 8, 803–818 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Eingegangen: 24. Januar 2022

Angenommen: 24. Januar 2023

Veröffentlicht: 23. März 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Naturmikrobiologie (2023)