Affinitätsmikrofluidik ermöglicht hohe

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1147 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Der durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg vermittelte Proteinabbau reguliert Signalereignisse bei vielen physiologischen und pathologischen Zuständen. In-vitro-Abbautests haben maßgeblich zum Verständnis der Regulierung der Zellproliferation und anderer grundlegender zellulärer Prozesse beigetragen. Diese Tests sind direkt, zeitspezifisch und sehr informativ, aber auch mühsam und basieren typischerweise auf einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit niedrigem Durchsatz, gefolgt von Autoradiographie oder Immunblotting. Wir präsentieren Protein Degradation on Chip (pDOC), eine MITOMI-basierte integrierte Mikrofluidik-Technologie zur Entdeckung und Analyse des Proteinabbaus in zellfreien Extrakten. Die Plattform beherbergt Hunderte von Mikrokammern, in denen der Proteinabbau schnell, gleichzeitig und unter Verwendung kleinster Mengen an Reagenzien in einer oder mehreren physiochemischen Umgebungen untersucht wird. Im Wesentlichen stellt pDOC eine empfindliche Multiplex-Alternative zum herkömmlichen Abbauassay dar, mit Relevanz für die biomedizinische und translationale Forschung im Zusammenhang mit regulierter Proteolyse.

Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System ist ein zentrales Regulationsmodul, durch das der Proteinspiegel in allen eukaryotischen Zellen ausgeglichen bleibt. Eine Abweichung von der gewünschten Menge jedes Proteins zu einem bestimmten Zeitpunkt kann schädlich für die Zelle sein und zu dysfunktionalen Geweben und einer Vielzahl von Krankheiten beim Menschen führen, darunter Krebs, Mukoviszidose und neurodegenerative Erkrankungen1,2.

An der Kernkaskade, die der Ubiquitinierung zugrunde liegt, sind drei Enzyme beteiligt: ​​Das E1-Enzym bindet das Ubiquitinmolekül kovalent und aktiviert es für die Übertragung auf ein E2-konjugierendes Enzym. Anschließend interagiert das Ubiquitin-konjugierte E2 mit einem E3-Ubiquitin-Ligase-Enzym, das den Transfer von Ubiquitin-Molekülen vom E2 zum Zielprotein katalysiert, typischerweise über eine Isopeptidbindung an einen Lysinrest. Wiederholte Ubiquitinierungsereignisse können eine oder mehrere Ketten von Ubiquitin-Einheiten auf dem Zielprotein bilden (d. h. Polyubiquitinierung). Eine vom Proteasom erkannte Polyubiquitinkette löst den Proteinabbau aus1,2. Hunderte verschiedener E3-Enzyme steuern die enorme funktionelle Reichweite und Spezifität des gesamten Ubiquitinierungsprozesses. Im Hinblick auf die Zellproliferation und die Regulierung des Zellzyklus sind die Ubiquitin-Ligasen Anaphase-Promoving Complex/Cyclosome (APC/C) und Skp1-Cullin-F-Box-Proteinkomplex (SCF) besonders wichtig3,4,5. Die Substratspezifität beider Komplexe hängt von Co-Aktivatoren ab: Cdc20 und Cdh1 für APC/C und einem von mehreren F-Box-Proteinen für SCF, z. B. Skp2 und β-TrCP6,7,8. Insgesamt gewährleistet die geordnete Proteolyse, die durch zellzyklusregulierte E3-Enzyme vermittelt wird, einen unidirektionalen Zellzyklus in allen Eukaryoten6,7,8,9,10.

Während einige Formen von Ubiquitinketten Proteine ​​für den Abbau durch das Proteasom markieren, regulieren Monoubiquitinierung und andere Formen der Polyubiquitinierung Signalkaskaden über Proteasom-unabhängige Wege11. Darüber hinaus kann die Ubiquitinierung durch Enzyme namens Deubiquitinasen so rückgängig gemacht werden, dass eine Proteolyse verhindert werden kann12. Andererseits ist der proteasomale Abbau möglicherweise nicht immer mit der Ubiquitinierung gekoppelt13. Daher kann der Proteinabbau nicht aus der Ubiquitinierung abgeleitet werden und muss direkt bestimmt werden.

Proteinabbautests in zellfreien Extrakten, auch als „zellfreie Systeme“ bekannt, waren in der zellbiologischen Forschung von entscheidender Bedeutung und ermöglichten direkte und quantitative Analysen der Ubiquitin-vermittelten Proteolyse in physiologisch relevanten Umgebungen. Tatsächlich wurden viele der Zellzyklusprinzipien durch die Überwachung des Abbaus von Zellzyklusproteinen in Extrakten aus Froscheiern oder zyklischen menschlichen Zellen entdeckt (siehe zum Beispiel 14,15,16,17,18,19,20). Der umfangreiche Einsatz dieser „Abbautests“ in der heutigen modernen Zeit ist ein Beweis für ihre Wirksamkeit (siehe zum Beispiel21,22,23). Interessanterweise haben herkömmliche Abbautests nie wirklich von modernen Technologien profitiert und basieren immer noch auf Gelelektrophorese, Autoradiographie oder Immunblotting sowie großen Mengen an biologischem Material.

Integrierte Mikrofluidik und pneumatische Mikroventile ebneten den Weg zu Proteinchips, in denen angeordnete Proteine ​​frisch in Retikulozytenlysaten exprimiert werden, die die ordnungsgemäße Proteinfaltung und -aktivität aufrechterhalten24. Die Zielproteine ​​werden entweder auf dem Chip oder extern exprimiert und anschließend über eine bestimmte Oberflächenchemie in Mikrokammern immobilisiert. Anschließend kann eine große Anzahl fluorometrischer Tests in Tausenden von Mikrokammern unter Verwendung winziger Mengen an Reagenzien durchgeführt werden. In den letzten Jahren haben wir mehrere Anwendungen entwickelt, die auf dem mechanisch induzierten Einfangen molekularer Wechselwirkungen (MITOMI) basieren, für die gemultiplexte In-situ-Analyse von posttranslationalen Proteinmodifikationen (PTMs) und nichtkovalenten Wechselwirkungen24,25,26,27,28,29,30.

Die Kombination aus integrierter Mikrofluidik, Proteinarrays und zellfreien Systemen birgt großes Potenzial in der biomedizinischen Forschung. In dieser Studie demonstrieren wir eine MITOMI-basierte Plattform zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinabbaus in zellfreien Extrakten. Die Methode mit dem Namen „pDOC“ (Protein Degradation on Chip) bietet eine schnelle Multiplex-Alternative zur klassischen Methode, mit der die Proteasom-vermittelte Proteolyse seit fast einem halben Jahrhundert nahezu unverändert in vitro getestet wird.

Der pCS2-Flag-FA-Vektor wurde durch Annealing von Flag-Tag-Oligos und Ligieren des endgültigen Fragments in den pCS2-FA-Vektor unter Verwendung von BamHI- und FseI-Restriktionsenzymstellen (RE) erzeugt. pCS2-Flag-FA-Securin-GFP wt- und ∆64-Variantenplasmide wurden durch Klonieren von wt- oder ∆64 Securin-GFP27 in den pCS2-Flag-FA-Vektor unter Verwendung von FseI (5') und AscI (3') flankierten Primern erzeugt. Das Plasmid pCS2-FA-Geminin-GFP wurde beschrieben27. pCS2-FA-Geminin∆27-GFP wurde durch Amplifikation des offenen Leserahmens (ORF) von Geminin-GFP beginnend am Codon für Methionin 28 unter Verwendung von FseI (5') und AscI (3') flankierten Primern erzeugt. Das PCR-Produkt wurde in den pCS2-FA-Vektor rekloniert. Die Plasmide pCS2-Flag-FA-Geminin-GFP wt und ∆27-Variante wurden durch Klonieren jeder der beiden Geminin-GFP-Varianten in den pCS2-Flag-FA-Vektor unter Verwendung von FseI- und AscI-RE-Stellen erzeugt. Das Flag-p27-myc-Fragment wurde durch eine zweistufige Assemblierungs-PCR unter Verwendung der pCS2-Flag-FA-p27-GFP-Matrize, eines ersten Primersatzes, der ein Flag-Tag (5') und ein Myc-Tag (3') enthielt, und a erzeugt zweiter Primersatz, der einen T7-Promotor (5') und eine T7-Terminatorsequenz (3') enthält. Der N-Terminus von Geminin (110 Aminosäuren), der an monomeres Azami-Green (mAG) gebunden war, wurde unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Matrize31 und eines Primersatzes, flankiert von FseI- (5') und AscI-RE-Stellen (3'), amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in das pcS2FA-FLAG-Plasmid kloniert. Letzteres wurde als Vorlage verwendet, um durch Mutagenese eine ∆27-Variante zu erzeugen (QuikChange® Lightning-Kits von Agilent; 210513). K-zu-A- und RxxL-zu-GxxV-Substitutionen (einzelner Aminosäurecode) wurden durch Mutagenese erzeugt. Weitere Einzelheiten finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Abgesehen von mAG-Geminin trugen alle GFP-markierten Proteine ​​eine verstärkte Variante des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP). Oligosequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

NDB-Zellen basieren auf der HEK293-Zelllinie. Eine detaillierte Beschreibung dieses Zellsystems finden Sie in Lit. 17. NDB- und HeLa S3-Zellen (ATCC; #CCL-2.2) wurden in Gewebekulturschalen gehalten, die Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) enthielten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (Biological Industries; #01-055-1A, #04-001-1A, #03-020-1B, #03-031-1B). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten, 5 % CO2-haltigen Atmosphäre gehalten. HeLa S3-Zellen wurden entweder auf Schalen oder in 1-l-Glasdrehkolben in Suspension (80 U/min) kultiviert. NDB-Zellen wurden in Gegenwart von 5 μg/ml Blasticidin (Life Technologies; #A11139-03) kultiviert, um das pcDNA6/TR-Plasmid zu erhalten, das den ORF für den Tet-Repressor trägt.

Zur Synchronisation der späten Mitose wurden NDB-Zellen in Schalen mit 150 mm/Durchmesser kultiviert. Nachdem eine Konfluenz von etwa 75 % erreicht war, wurden die Zellen 22 Stunden lang mit 1 μg/ml Tetracyclin (Sigma-Aldrich; Nr. 87128) behandelt und zur Extraktvorbereitung geerntet. Zur S-Phasen-Synchronisation wurden HeLa S3-Zellen 72 Stunden lang in Suspension bis zu einer Konzentration von etwa 5 × 105 Zellen/ml kultiviert. Die Zellen wurden dann 22 Stunden lang mit 2 mM Thymidin ergänzt, mit DMEM gewaschen (zweimal, 5 Minuten, 250 × g) und für weitere 9 Stunden in vorgewärmtes frisches Medium (37 ° C) freigesetzt. Anschließend wurde die Zellkultur vor der Ernte zur Extraktvorbereitung 19 Stunden lang erneut mit 2 mM Thymidin ergänzt.

HeLa S3-Extrakte: S-Phasen-synchrone HeLa S3-Zellen wurden mit eiskaltem 1× PBS gewaschen und in einem Quellpuffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol [DTT] usw.) lysiert Protease-Inhibitor-Cocktail [Roche; #11836170001]), ergänzt mit einer energieregenerierenden Mischung, E-Mix (1 mM ATP, 0,1 mM Ethylenglycol-bis [β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetraessigsäure). Säure [EGTA], 1 mM MgCl2, 7,5 mM Kreatinphosphat, 50 μg/ml Kreatinphosphokinase). Die Zellen wurden 30 Minuten lang auf Eis inkubiert, durch Gefrier-Auftau-Zyklen in flüssigem Stickstoff homogenisiert und zehnmal durch eine 21-G-Nadel geleitet. Die Extrakte wurden durch anschließende Zentrifugation (17.000 × g; 10 und 40 Minuten) geklärt und bei –80 °C gelagert. Mitotische NDB-Extrakte: Tet-induzierte NDB-Zellen wurden aus 20–24 150-mm-Schalen durch vorsichtiges Waschen mit eiskaltem PBS gesammelt. Extrakte wurden wie oben für HeLa S3-Zellen beschrieben hergestellt. Weitere Einzelheiten finden Sie unter 17,32.

Zielproteine ​​wurden in vitro unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozytenlysat (TNT-gekoppeltes Retikulozytensystem; Promega; Nr. L4600, Nr. L4610) exprimiert, ergänzt entweder mit einer 35S-Methionin/SL-Cystein-Mischung (PerkinElmer; Nr. NEG772002MC) für den Röntgennachweis oder mit unmarkiertem Methionin (Promega #L118A) und FluoroTect™ GreenLys (Promega #L5001).

Abbautests wurden in 20 μl Zellextrakt, ergänzt mit 1 μl 20-facher Energieregenerierungsmischung (siehe oben), 1 μl 10 mg/ml Ub-Lösung (Boston Biochem; #U-100H) und 1 μl radioaktiv markierter in vitro-Translation durchgeführt Protein von Interesse. Als Negativkontrolle wurde das Reaktionsgemisch mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 (20 μM; Boston Biochem; Nr. I-130) ergänzt. Die Reaktionsmischungen wurden bei 28 °C inkubiert und in Abständen von 15–20 Minuten wurden Proben von 4–5 µl gesammelt. Off-Chip-Detektion: Zeitpunktproben wurden mit 4× Laemmli-Probenpuffer (BIO-RAD #1610747) gemischt, denaturiert (10 Min., 95 °C) und durch SDS-PAGE aufgelöst. Die Gele wurden 20 Minuten lang in einer Fixierlösung aus Methanol/Essigsäure (10/7,5 %) eingeweicht, im Vakuum und bei Hitze getrocknet und 24–72 Stunden lang einem Phosphorschirm (Fuji) ausgesetzt. In vitro translatierte Proteine ​​wurden durch Autoradiographie mit dem Typhoon FLA 9500 Phosphorimager (GE Healthcare Life Sciences) sichtbar gemacht. Die Signalintensität (korrigiert um das Hintergrundsignal) wurde mit der ImageJ-Software gemessen und auf das Signal bei t0 normiert. Alle Diagramme wurden mit der Microsoft Excel-Software, Version 16.20, erstellt. Mittel- und SE-Werte wurden aus drei oder vier unabhängigen Abbautests berechnet. On-Chip-Detektion: Zeitpunktproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vor der Detektion wurden die Proben auf Eis aufgetaut, 5 Minuten lang durch den Chip geleitet und in Proteinkammern unter dem „Knopf“-Ventil immobilisiert (siehe „Oberflächenchemie“ unten). Als nächstes wurden die „Knopf“-Ventile geschlossen, sodass ungebundenes Material mit PBS gewaschen werden konnte. Der Gehalt an Zielproteinen (vor und nach Abbaureaktionen) wurde durch 488-nm-Anregung und einen 535/25-nm-Emissionsfilter bestimmt. Der Proteingehalt konnte auch durch Immunfluoreszenz unter Verwendung fluoreszierend markierter Antikörper (Anti-Flag-Alexa 647, μg/ml, Nr. 15009; Cell Signaling, Danvers, MA, USA) gemessen werden. Diese Antikörper wurden in das Gerät eingeleitet und mit den immobilisierten Proteinen unter dem „Knopf“ für 20 Minuten bei RT inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden nach dem Schließen des Knopfventils mechanisch mit PBS gewaschen. Hier wurden die Zielproteingehalte durch 633-nm-Anregung und einen 692/40-nm-Emissionsfilter bestimmt.

Das mikrofluidische Gerät besteht aus zwei PDMS-Schichten. Die Siliziumwafer werden fotolithografisch beschrieben (Heidelberg MLA 150). Anschließend wird die Soft-Lithographie-Phase unter Verwendung von Silikonelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) und seinem Härter durchgeführt, um die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Die mikrofluidischen Geräte bestehen aus zwei ausgerichteten PDMS-Schichten, der Fluss- und der Kontrollschicht, die unter Verwendung unterschiedlicher Verhältnisse von PDMS und seinem Härter hergestellt werden; 5:1 und 20:1 für die Kontroll- bzw. Flussebene. Die Kontrollschicht wird entgast und 30 Minuten bei 80 °C gebacken. Die Fließschicht wird zunächst 60 s lang bei 2000 U/min schleuderbeschichtet (Laurell, USA) und 30 min lang bei 80 °C gebacken. Anschließend werden die Fluss- und Kontrollschichten mithilfe einer automatischen Aligner-Maschine (maßgefertigt) unter einem Stereoskop ausgerichtet und zur endgültigen Bindung 1,5 Stunden lang bei 80 °C gebacken. Anschließend wird das zweischichtige Bauelement vom Wafer abgezogen und mittels Plasmabehandlung (Luft, 30 %, 30 s) an ein Deckglas gebunden. Während des Betriebs ist das Gerät über Tygon®-Schläuche an einen pneumatischen Verteiler angeschlossen und wird automatisch auf der Grundlage programmierter Befehle betrieben.

Biotinyliertes BSA (1 μg/μl, Thermo) wird 25 Minuten lang durch das Gerät geleitet und ermöglicht so seine Bindung an die Epoxidoberfläche. Zusätzlich zum biotinylierten BSA werden 0,5 μg/μl NutraAvidin (Pierce, Rockford, IL) hinzugefügt (20 Minuten fließen lassen). Das „Knopf“-Ventil wird dann geschlossen und biotinyliertes PEG (1 μg/μl, (PG2-AMBN-5k, Nanocs Inc.)) wird 20 Minuten lang überströmt, wodurch die Flussschicht mit Ausnahme des Knopfbereichs passiviert wird. Anschließende Passivierung , das „Knopf“-Ventil wird freigegeben und ein Fluss von 0,2 μg/μl biotinylierten Anti-GFP-Antikörpern (Abcam; #ab6658, Cambridge, Vereinigtes Königreich) oder 0,01 μg/μl biotinylierten Anti-Flag-Antikörpern (Cell Signaling; #2908 S Danvers) erfolgt , MA, USA) wurden aufgetragen. Die Antikörper banden an das exponierte NutraAvidin, insbesondere an den Bereich unter dem „Knopf“, und erzeugten eine Reihe von Anti-GFP- oder Anti-Flag-Tags. Zwischen den Schritten wurde PBS-Puffer zum Waschen verwendet. Im Fall der p27-Immobilisierung wurde die Oberflächenchemie mit 0,2 μg/ml Esel-Anti-Maus-ganzen biotinylierten Anti-IgG-Antikörpern (Nr. 715-065-150, Jackson Immuno Research Laboratories, Maryland, USA) durchgeführt, gefolgt von einem 20-minütigen Fluss von 6,5 μg/ml μg/ml Anti-p27-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg Deutschland; #1641 Maus).

Flag-Securin-GFP (Gewicht und ∆64 mut) und p27-GFP-IVT-Produkte wurden in den Chip eingeleitet und über den GFP-Tag auf der Oberfläche unter dem „Knopf“ an den Proteinkammern immobilisiert, anschließend mit PBS-Puffer gewaschen und gescannt. Als nächstes wurden die „Knopfventile“ geöffnet und die Extraktreaktionsmischungen mit den Proteinkammern 60 Minuten lang (30 °C) inkubiert. Während der Reaktion wurde alle 15 Minuten der Spiegel des reminierenden Zielproteins durch das GFP-Signal bestimmt. Der Rückgang des GFP-Signals korrelierte mit der Verschlechterung. Nach der Subtraktion des Hintergrundsignals wurden die GFP-Signale auf das Signal bei t0 (Wert 1) oder zwischen 1 (maximales Signal) und 0 (minimales Signal) normalisiert.

Für die Analyse und Präsentation der Bilder wurden ein neu geladener LS-Microarray-Scanner, GenePix7.0 (Molecular Devices) und die Bildanalysesoftware ImageJ verwendet. Als Hintergrund wurde das um das Knopfventil gemessene Signal betrachtet, da dort keine Immobilisierung von Proteinen zu erwarten war. Dennoch wird immer ein gewisses Hintergrundsignal erkannt, das aus der unspezifischen Anlagerung von Antikörpern an die Geräteoberfläche resultiert. Wir haben das Hintergrundsignal um die Schaltflächen in einem Ring der Größe 2 R mit 2-Pixel-Abstand subtrahiert (siehe Zusatzmaterial in 27).

Proteinproben wurden mit x4 Laemmli-Puffer gemischt, denaturiert (10 Min., 96 °C) und auf frisch hergestelltem 10 % Acrylamidgel unter Verwendung eines Tris-Glycin-Laufpuffers aufgelöst. Anschließend wurden die Proteine ​​mithilfe des Trans-Blot Turbo-Transfersystems (Bio-Rad) elektrotransferiert auf eine Nitrozellulosemembran (Bio-Rad; Nr. 162-0115). Zur Überprüfung der Übertragungsqualität wurde Ponceau S-Lösung (Sigma-Aldrich; Nr. 81462) verwendet. Die Membran wurde gewaschen (TBS), blockiert (5 % Magermilch in TBST) und mit Antikörperlösung (2,5 % BSA und 0,05 % Natriumazid in PBS) inkubiert (RT, 1 Stunde), bevor sie mit Anti-Securin (Abcam; #) geblottet wurde. AB3305) Primärantikörper (RT, 2 h). Der mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-Maus-Sekundärantikörper wurde von Jackson ImmunoResearch (Nr. 115-035-003) erworben. Das ECL-Signal wurde mit EZ-ECL (Biological Industries; Nr. 20-500-171) erkannt.

Insgesamt werden Einzelheiten zum experimentellen Design und zur Statistik in den entsprechenden Abschnitten angegeben. Die P-Werte wurden auf der Grundlage eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests berechnet. Bei dreifach durchgeführten Gelanalysen; Diagramme zeigen Mittel- und Standardfehlerwerte (SE). Statistiken für die On-Chip-Analyse wurden von n = 10 bis 57 Zelleinheiten abgeleitet. Es werden Mittel- und SE-Werte angezeigt. Statistische Analysen und Grafiken wurden mit der Software Microsoft Excel v16.65 erstellt.

Wir haben pDOC entwickelt, um mehrere Strategien zur Analyse des Proteinabbaus in vitro, insbesondere in zellfreien Systemen, zu unterstützen. Das Gerät basiert auf einem integrierten Mikrofluidikchip von MITOMI, der ursprünglich zur Quantifizierung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen im Gleichgewicht entwickelt wurde24,33. Das MITOMI-Modul wurde so modifiziert, dass es eine Anordnung von 16 × 64, 32 × 32 oder 32 × 16 Mikrokompartimenten enthält. Der letztgenannte Chip wurde auch entwickelt, um paralleles Laden zu ermöglichen (siehe Schaltpläne in Abb. 1a). Jedes Kompartiment, also jede Zelleinheit (Abb. 1b), ist in zwei Kammern unterteilt und wird durch drei Ventile gesteuert: ein „Hals“-Ventil, das die Diffusion (Mischung) von Material aus Kammer I in die „Proteinkammer“ steuert, in der ein spezifisches Zielprotein wird gefangen; ein „Sandwich“-Ventil, das die Zelleinheiten trennt; und das MITOMI-Knopfventil, das interagierende Moleküle darunter einfängt und so eine Momentaufnahme der Wechselwirkung im Gleichgewicht macht (Abb. 1b). Kammer I kann auf zwei Arten beladen werden: 1) „Gelartiges“ Laden, das das sequentielle oder parallele Laden von 32 Proben ermöglicht. Dies wird durch eine Reihe einzelner Eingangskanäle erreicht, die von Mikroventilen gesteuert werden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die kürzere Zeit bis zum Ergebnis, seine relative Einfachheit und die konzeptionelle Ähnlichkeit zu herkömmlichen gelbasierten Protokollen. 2) Microarray-Beladung, dh vorgespottete Open-Reading-Farmen (ORFs) werden auf dem Chip transkribiert, um eine Reihe frisch exprimierter Proteine ​​zu erzeugen. Dieser Ansatz erhöht den Durchsatz. Nicht weniger wichtig ist, dass dadurch der Reagenzienverbrauch im Vergleich zum herkömmlichen Assay um mindestens drei Größenordnungen gesenkt wird. Jede Reaktion hat ein Volumen von weniger als einem Nanoliter. Der gemeinsame Verteiler wird dann verwendet, um gemeinsame Materialien in die verschiedenen Abschnitte des Geräts zu laden (z. B. für die Oberflächenchemie). Darüber hinaus umfassen pDOC-Chipdesigns die Aufteilung der Hauptsteuerung der drei Ventile in Abschnitte des Chips, die unabhängig voneinander aktiviert und gesteuert werden können. Im Vergleich zur Steuerung jedes Ventiltyps für den gesamten Chip verbessert diese Trennung nicht nur die Ventilreaktion, sondern, was noch wichtiger ist, sie ermöglicht Zeitreaktionstests auf dem Chip. Innerhalb jedes Abschnitts können Experimente in allen Zelleinheiten parallel durchgeführt werden, was Multiplexanwendungen der Art ermöglicht, wie sie in unseren vorherigen Geräten gezeigt wurden24,25,26,34.

Ein pDOC ist eine MITOMI-basierte mikrofluidische Plattform. Das Gerät umfasst Flussschichten (grün) und Kontrollschichten (Magenta) sowie mehrere Module: 1) einen gemeinsamen Verteiler, der das Laden von Materialien ermöglicht und in Kombination mit einem Mikroarray bis zu 512 verschiedene Experimente ermöglichen kann; 2) Parallele Ladeeingänge ermöglichen eine gelartige Beladung von bis zu 32 verschiedenen Versuchsbedingungen; und 3) MITOMI-Modul mit 512 Zelleinheiten, das den Abbautestprozess steuert. b Eine Darstellung zweier Zelleinheiten. Jede Zelleinheit (gekennzeichnet durch einen schwarz gepunkteten Rahmen) besteht aus zwei Kammern, die durch drei integrierte pneumatische Ventile gesteuert werden. Das Gesamtvolumen jeder Einheit beträgt etwa 1 Nanoliter. Die beiden Kammern werden durch das „Halsventil“ (I) getrennt. Die Trennung verschiedener Zelleinheiten erfolgt über Sandwichventile (II). Proben, die Zielproteine ​​(IVT-Produkte) enthalten, werden in die Proteinkammer geladen und über biotinylierte Antikörper immobilisiert, die entweder Protein- oder Tag-spezifisch sein können. Die Zielproteine ​​werden zur Quantifizierung über das MITOMI-Knopfventil (III) eingefangen, während die verbleibenden ungebundenen Biomaterialien weggespült werden. Die Strömungsrichtung innerhalb des Geräts wird durch grüne Pfeile angezeigt. c Links ein Bild einer Zelleinheit innerhalb des MITOMI-Arrays. Zielproteine ​​können in der Proteinkammer immobilisiert und auf verschiedene Arten quantifiziert werden (rechts dargestellt): i) Ein Beispiel für ein Zielprotein, das eine fluoreszierende Markierung (z. B. GFP) zur Erkennung (siehe grün leuchtende Markierung) und eine nicht-fluoreszierende Markierung trägt (z. B. GFP). fluoreszierende Markierung zur Immobilisierung; ii) Ein mit GFP markiertes Zielprotein sowohl zur Immobilisierung (durch Anti-GFP-Antikörper) als auch zum Nachweis; iii) Das Zielprotein ist nicht markiert. Der Nachweis basiert auf fluoreszierendem Lysin (Lys), das während der In-vitro-Translation eingebaut wird. Die Immobilisierung erfolgt über proteinspezifische Antikörper. iv) Das Zielprotein wird über Tag- oder Protein-spezifische Antikörper immobilisiert und durch Immunfluoreszenz über an Fluorophor gekoppelte Tag-spezifische Antikörper nachgewiesen. Insgesamt beruht die On-Chip-Immobilisierung von Zielproteinen auf biotinylierten Antikörpern. Eine Immobilisierung über nicht biotinylierte Antikörper ist möglich, wenn die Oberflächenchemie biotinyliertes IgG umfasst.

Wie bei den klassischen Abbauassays werden Zielproteine ​​für pDOC-Analysen in vitro translatiert (IVT) unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozytenlysat, das eine korrekte Faltung und posttranslationale Modifikationen (PTMs) ermöglicht. Die IVT-Produkte werden durch Biotin-Avidin-Bindung auf der Glasoberfläche des Chips immobilisiert. Hierzu werden unter dem Knopfventil spezifische biotinylierte Antikörper appliziert. Nach dem Herausziehen des Zielproteins wird das ungebundene Material, wie z. B. Retikulozytenlysat und Zellextrakt, weggewaschen. Anschließend wird der gesamte Chip bis auf den Bereich unterhalb des Buttons mit PEG-Biotin passiviert (Abb. 1b). Die gebundenen Zielproteine ​​werden fluorometrisch quantifiziert. Weitere Einzelheiten finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen25,26,34.

Das Gerät ist mit mehreren Strategien der Oberflächenchemie und möglichen Versuchsaufbauten kompatibel (dargestellt in Abb. 1c): 1) Das Zielprotein ist sowohl am N'- als auch am C'-Terminus markiert. Ein Tag dient zur Immobilisierung über tagspezifische biotinylierte Antikörper und der zweite Tag ist ein fluoreszierendes Protein (z. B. GFP), das zur Detektion verwendet wird. 2) Ein fluoreszierendes Protein wird sowohl zur Immobilisierung als auch zum Nachweis verwendet. 3) Das Zielprotein wird in Lysat, das fluoreszierendes Lysin (grünes Lys) enthält, translatiert und durch proteinspezifische Antikörper immobilisiert. 4) Das Zielprotein ist doppelt markiert. Hier wird jedoch ein Tag zur Immobilisierung verwendet, während der zweite Tag durch den fluoreszierenden Antikörper immundetektierbar ist. Wichtig ist, dass die Immobilisierung mit nicht biotinylierten Antikörpern durchgeführt werden kann, wenn die Oberflächenchemie auch biotinyliertes Anti-IgG umfasst. Diese Flexibilität der Proteinimmobilisierung und -quantifizierung vereinfacht die Assay-Optimierung entsprechend spezifischer Anforderungen und Einschränkungen sowie die allgemeine Vielseitigkeit der Plattform.

Vom Konzept her ist die Analyse des Proteinabbaus durch pDOC direkt, einfach und schnell; Die Signalerkennung basiert auf der In-situ-Quantifizierung, wodurch die Gelelektrophorese und alle anderen gelbezogenen Verfahren, z. B. Fixierung, Trocknung, Autoradiographie oder Immunblotting und Belichtung, entfallen. Unser erstes Ziel bestand darin zu untersuchen, ob die Signalempfindlichkeit und der Dynamikbereich von pDOC eine zeitbasierte Quantifizierung von IVT-Produkten ermöglichen, deren Abbau in zellfreien Extrakten im Röhrchen, also außerhalb des Chips, untersucht wurde. Als Machbarkeitsnachweis verwendeten wir mitotische Extrakte aus HEK293-Zellen, die aufgrund hoher Mengen an nicht abbaubarem Cyclin-B1 in einem anaphaseähnlichen Zustand blockiert sind. Dieses mitotische zellfreie System, im Folgenden als NDB bezeichnet, rekapituliert die APC/CCdc20-vermittelte Proteolyse der Zellzyklusproteine ​​Securin und Geminin17,35. Herkömmliche Abbautests von radioaktiv markiertem Flag-Securin-GFP und Flag-Geminin-GFP (IVT-Produkte) in mitotischen NDB-Extrakten sind in Abb. 2a dargestellt (siehe auch Abb. S1). Kontrollexperimente mit nicht abbaubaren Mutantenvarianten (Geminin ∆27 und Securin ∆64) belegen die Spezifität des Tests. Äquivalente nichtradioaktive IVT-Produkte wurden auf ähnliche Weise untersucht. Zuerst führten wir einen Endpunkttest durch (Abb. 2b). Nach 60-minütiger Inkubation mit mitotischen NDB-Extrakten wurden die Reaktionsproben über separate Kanäle auf pDOC geladen und auf GFP-Fluoreszenz gescannt. Kontrollreaktionen, bei denen IVT-Produkte in PBS inkubiert wurden, ermöglichten es uns, den Spiegel jedes Zielproteins bei t60 min (Verhältnis Extrakte/PBS) zu normalisieren und Hintergrundsignale abzuschätzen. Insgesamt zeigt der On-Chip-Nachweis eine starke Verringerung des Geminin- und Securin-Spiegels nach der Inkubation in mitotischen NDB-Extrakten, wohingegen nicht abbaubare Varianten stabil blieben und etwa 80 % der Kontroll-GFP-Signale in PBS zeigten. Zu diesem Zeitpunkt stellten wir fest, dass die Hintergrundsignale von Retikulozytenlysat, Zellextrakten und unspezifischer Immobilisierung gering waren (Abb. S2).

a Zeitabhängiger Abbau von 35S-markiertem Flag-Securin-GFP, Flag-Geminin-GFP und ihren nicht abbaubaren Varianten (∆64 bzw. ∆27) in mitotischen NDB-Extrakten (20 µl), ergänzt mit E-Mix und Ubiquitin . Die zeitabhängige Proteolyse wurde durch SDS-PAGE und Autoradiographie gelöst. b Äquivalente Tests wurden mit nichtradioaktiven IVT-Produkten durchgeführt. Die Zielproteine ​​wurden 1 Stunde lang in einer Reaktionslösung inkubiert, die entweder Extrakte oder PBS (Kontrolle) enthielt. Aliquote jeder Reaktionsmischung (5 µl) wurden dann über separate Kanäle, die jeweils Dutzende Zelleinheiten enthielten, direkt auf einen Chip geladen. Zielproteine ​​wurden über biotinylierte Anti-GFP-Antikörper an Proteinkammern immobilisiert. Der GFP-Tag wurde auch zur Quantifizierung verwendet. GFP-Signale wurden aus 14–19 Zelleinheiten pro Zielprotein und Reaktionsbedingung (Extrakte vs. PBS) berechnet. Boxplots zeigen Verhältnisse der GFP-Signale (Extrakte/PBS) bei t60 min. Mittelwert (x) und Median (-) sind angegeben. *p-Wert < 0,001. Es werden repräsentative Rohdaten gezeigt, die den Nachweis der vier Zielproteine ​​auf dem Chip veranschaulichen. c Der Abbau der Flag-Securin-GFP-Variante wurde im Röhrchen wie in B beschrieben getestet. Hier wurden jedoch alle 15 Minuten Aliquots eingefroren. Anschließend wurden Zeitrafferproben zur Analyse auf den Chip geladen. Zielproteine ​​wurden über Anti-GFP-Antikörper in Proteinkammern immobilisiert und anhand der GFP-Fluoreszenz quantifiziert. Der zeitabhängige Abbau von wt vs. mutiertem Securin wurde auf der Grundlage des 35S-Signals (Standardanalyse; n = 3) und der GFP-Fluoreszenz (On-Chip-Analyse) quantifiziert. Die Diagramme zeigen mittlere Signale und Standardfehlerbalken. Die mittleren Signale wurden aus 26 Zellen berechnet Einheiten und normalisiert zwischen maximalen (1, t0) und minimalen (0, t60 min) Werten, was einen ordnungsgemäßen Vergleich zwischen zwei sehr unterschiedlichen Nachweismethoden ermöglicht. Fehlerbalken werden angezeigt. d Äquivalentes Experiment zu (c), durchgeführt mit Flag-Geminin-GFP , mit der Ausnahme, dass die Immobilisierung auf Anti-Flag-Antikörpern basierte. n = 30–40 Zelleinheiten.

Als nächstes haben wir getestet, ob pDOC verwendet werden kann, um zuverlässige kinetische Informationen zum Proteinabbau zu erhalten. Flag-Securin-GFP und Flag-Geminin-GFP wurden 60 Minuten lang in mitotischen NDB-Extrakten inkubiert, und die Reaktionsproben wurden alle 15 Minuten in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach dem schnellen Auftauen wurden Proben, die fünf Zeitpunkte repräsentierten, zur Signalquantifizierung auf den Chip geladen. Vergleichbare Analysen wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie durchgeführt. Zur Kontrolle wurden auch die nicht abbaubaren Flag-Securin∆64-GFP- und Flag-Geminin∆27-GFP-Varianten mittels Autoradiographie untersucht. Angesichts der großen Unterschiede zwischen den beiden Nachweismethoden wurden die GFP- und Autoradiographiesignale zwischen 0 und 1 normalisiert, was bedeutet, dass das Signal bei t60 min von allen anderen Zeitpunkten abgezogen wurde. Die resultierenden Werte wurden auf das maximale Signal bei t0 normiert und aufgezeichnet. Wie in Abb. 2c, d gezeigt, zeigten die On-Chip-Analyse durch pDOC und die Off-Chip-Analyse durch SDS-PAGE-Autoradiographie nahezu identische Abbaumuster von Flag-Securin-GFP und Flag-Geminin-GFP. Beachten Sie, dass Reaktionscocktails 1 μl IVT, 20 μl Extrakte und 2 μl Ubiquitin/E enthielten. Mischen Sie die Lösung gemäß unserem Standardprotokoll17,27,36. Zu jedem Zeitpunkt wurden 5 μl Reaktionsmischungen für einen Zeitraum von 5 Minuten durch Proteinkammern mit offenen MITOMI-Knopfventilen geleitet, um die Immobilisierung des Zielproteins zu ermöglichen, während die Halsventile geschlossen waren. Dieses Ladeprotokoll ermöglichte eine klare Visualisierung des Zielproteins ohne Bedenken hinsichtlich der Signalsättigung (Abb. S3). Wir kamen zu dem Schluss, dass pDOC sowohl Endpunkt- als auch Zeitverlaufsanalysen des Proteinabbaus in vitro erleichtert. Wichtig ist, dass Flag-Securin-GFP über biotinylierte Anti-GFP-Antikörper und nicht über Anti-Flag-Antikörper an Proteinkammern immobilisiert wurde. Auf diese Weise haben wir effektiv gezeigt, dass GFP sowohl zur Immobilisierung als auch zum Nachweis dienen kann, sodass zwei Tags nicht erforderlich sind. Insgesamt halten wir GFP für einen optimalen Tag für die Signalerkennung auf dem Chip.

Die Fusion eines fluoreszierenden Proteins mit einem Zielprotein kann jedoch die Proteinfaltung auf eine Weise verzerren, die die Proteolyse effektiv einschränkt. Daher kann in manchen Fällen eine Proteinquantifizierung unabhängig von fluoreszierenden Proteinmarkierungen wichtig sein. Besonders vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang die Flexibilität von pDOC. Abbildung 3a zeigt zwei alternative Konfigurationen, mit denen der Securin-Abbau auf dem Chip aufgezeichnet werden könnte: 1) direkte Erkennung durch Green-Lys; und 2) indirekter Nachweis durch In-situ-Immunfluoreszenz. Der Securin-Spiegel wurde bei t0 und t60 min gemessen. Beide Ansätze waren aufschlussreich und zeigten eindeutig den Abbau von Securin in der mitotischen NDB-Umgebung. Im Hinblick auf den direkten Nachweis ist es bemerkenswert, dass mit GFP markierte IVT-Produkte insgesamt heller sind als gleichwertige Proteine, die mit grünem Lys markiert sind. De facto zeigt dieses Experiment jedoch, dass integriertes grünes Lys die Proteolyse, die auf einer chemischen Modifikation von Lys-Resten basiert, nicht blockiert37. Der indirekte Nachweis durch Immunfluoreszenz beruht grundsätzlich auf zwei Tags (ein einzelner Tag kann nicht sowohl für die Immunmarkierung als auch für die Immobilisierung verwendet werden) und erfordert eine zusätzliche Inkubation von 30 Minuten. Die geringe Größe standardmäßiger immunnachweisbarer Tags minimiert jedoch das Risiko einer Proteinfehlfaltung und das helle Signal, das von kommerziellen Fluorophoren abgegeben wird, an die Antikörper gekoppelt sind, ist von Vorteil.

Der Abbau von Flag-Securin-Myc, Flag-Securin-GFP und Green-Lys-markiertem Flag-Securin (IVT-Produkte) in mitotischen NDB-Extrakten wurde 1 Stunde lang im Röhrchen untersucht. Die On-Chip-Analyse wurde auf verschiedene Arten durchgeführt: 1) Flag-Securin-Myc wurde durch Anti-Myc-Antikörper immobilisiert und durch Anti-Flag-Cy5-konjugierte Antikörper nachgewiesen; 2) Flag-Securin-GFP wurde immobilisiert und über den GFP-Tag nachgewiesen; und 3) Green-Lys-markiertes Flag-Securin wurde über Anti-Flag-Antikörper immobilisiert und durch das Green-Lys-Signal nachgewiesen. Anti-Myc/Flag/GFP-Antikörper sind biotinyliert. Diagramme und Rohdaten zeigen die Proteinspiegel bei t0 vs. t60 min. Die Signale werden bei t0 auf Maximalwerte normalisiert. Mittelwerte und Standardfehlerbalken werden angezeigt; n = 20–40 Zelleinheiten. *p-Wert < 0,001. b Der Abbau von Green-Lys-markiertem p27 (nicht markiert) und Flag-Securin-GFP wurde in S-Phasen-Extrakten untersucht und mit pDOC analysiert. p27 wurde über biotinylierte Anti-Maus-IgG- und Anti-p27-Antikörper immobilisiert. Zur Detektion wurde das Green-Lys-Signal verwendet. Flag-Securin-GFP wurde über biotinylierte Anti-Flag-Antikörper immobilisiert. Nach der Inkubation mit Zellextrakten wurden die Proteingehalte durch GFP- oder Green-Lys-Fluoreszenz in 15-Minuten-Intervallen quantifiziert. Die Diagramme zeigen Mittel- und Standardfehlerwerte, normiert auf das maximale Signal bei t0. n = 20 (p27) und 10 (Securin) Zelleinheiten.

Die Vielseitigkeit von pDOC wurde anhand von Tag-freiem p27 weiter demonstriert (Abb. 3b). Der Abbau von p27 wird durch die SCFSkp2-E3-Ligase und nicht durch APC/C vermittelt und ist mit der DNA-Synthesephase (S) des Zellzyklus koordiniert38. Der Abbau von p27 wurde in Extrakten aus S-Phasen-synchronen HeLa S3-Zellen untersucht und mit pDOC analysiert. Das Protein wurde über Anti-p27- und biotinylierte Anti-IgG-Antikörper immobilisiert und durch Green-Lys nachgewiesen. Die Analyse durch pDOC ergab die stereotype Instabilität von p27 in S-Phasen-Extrakten (Abb. 3b). Das Abbaumuster ähnelte dem mittels Autoradiographie gemessenen (Abb. S4). Somit kann pDOC für Abbautests von nicht markierten Proteinen verwendet werden. Darüber hinaus ist die Methode spezifisch und nicht auf eine bestimmte Art zellfreier Systeme beschränkt.

Zu den Vorteilen autoradiographiebasierter Abbautests gehören ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, eine hohe Spezifität des Signals und eine Linearität des Tests. Dies ist jedoch nicht ohne Kosten. Erstens ist das 35S-Isotop ein kurzlebiges Reagens mit einer Halbwertszeit von ca. 3 Monaten. Zweitens wird das Signal auf dem Gel über eine Vertiefung mit einer Breite von 4–5 mm verteilt (Standardgel mit 10 Vertiefungen). Drittens werden in einem Standard-Abbautest 1–2 μl IVT-Produkt in 20–30 μl Zellextrakten verdünnt, deren Proteinkonzentration etwa 20–25 mg/ml beträgt. Daher ist die pro Spur geladene IVT-Menge durch die maximale Trennkapazität des Gels begrenzt. Normalerweise laden wir 4–5 μl Reaktionsmischung in eine Vertiefung eines Standard-Minigels mit 10 Vertiefungen und einer Dicke von 1 mm. Viertens ist die In-vitro-Translation für große Proteine ​​aufgrund der Ribosomenprozessivität eine Herausforderung. Obwohl große Proteine ​​im Vergleich zu kleinen Proteinen mehr radioaktiv markiertes Methionin/Cystein enthalten, kann das Gesamtsignal des Volllängenproteins für eine zuverlässige Quantifizierung unpraktisch sein. Fünftens liegt die für ein qualitativ hochwertiges Signal erforderliche Belichtungszeit normalerweise im Bereich von 12–24 Stunden. Beachten Sie, dass die oben genannten Punkte 2–4 gleichermaßen relevant sind, wenn der Proteinabbau durch SDS-PAGE und Immunoblot untersucht wird. Was Punkt 5 betrifft, sind für das Immunblotting keine Langzeitbelichtungen erforderlich. Dennoch ist die gesamte Inkubationszeit mit Antikörpern lang. Darüber hinaus müssen IVT-Produkte in Immunoblot-basierten Tests markiert werden, um von den endogenen Proteinen in den Extrakten unterschieden zu werden. An dieser Stelle ist es wichtig zu beachten, dass unabhängig davon, ob der Abbau durch Autoradiographie oder Immunoblot untersucht wird, die informative Expression von IVT-Produkten vorher validiert werden muss, was an sich ein eintägiges Verfahren ist. Die gleichwertige Validierung durch pDOC erfolgt sofort.

Auf dem Chip lagen die Fluoreszenzsignale von Flag-Securin-GFP bei t60 min über dem Hintergrundniveau und waren im Vergleich zur Autoradiographie deutlicher erkennbar (Abb. 2a und 3a). Wenn jedoch das Signal bei t60 min von allen anderen Zeitpunkten abgezogen wurde, waren die gesamten Abbaumuster von Flag-Securin-GFP, wie durch pDOC und Autoradiographie festgestellt, ähnlich (Abb. 2c, d). Diese Beobachtung legt nahe, dass pDOC Proteinrückstände erkennt, die nach 60-minütiger Inkubation noch im Reaktionsgemisch vorhanden sind und durch Autoradiographie kaum oder gar nicht erkannt werden. Somit kann argumentiert werden, dass die Empfindlichkeit von pDOC die der herkömmlichen Autoradiographie übertrifft, und wenn ja, erleichtert pDOC nicht nur In-vitro-Abbautests, sondern reduziert auch den Reagenzienverbrauch und die Kosten pro Test erheblich. Um dies zu testen, verdünnten wir Flag-Securin-GFP in Retikulozytenlysat 4- und 10-fach und inkubierten das Substrat 1 Stunde lang in mitotischen NDB-Extrakten, wobei wir das ursprüngliche Volumenverhältnis Retikulozytenlysat/Extrakt von 1/20 (µl) beibehielten. Zeitpunktproben wurden mittels pDOC (basierend auf GFP-Fluoreszenz) analysiert. Äquivalente Experimente wurden parallel mit 35S-markiertem Flag-Securin-GFP nach dem herkömmlichen Assay durchgeführt (Abb. 4 und S5). Zur Verdeutlichung wurden radioaktiv markierte und nicht radioaktiv markierte Substrate gleichzeitig aus demselben TNT®/DNA-Lösungsgemisch exprimiert. Darüber hinaus wurden Abbautests einen Tag nach Lieferung der 35S-Met/35S-Cys-Lösung an unser Labor (~1175 Ci/mmol) durchgeführt und die Gele wurden über Nacht einem Phosphorschirm ausgesetzt. Doch wann immer das IVT-Substrat verdünnt wurde, lag das durch Autoradiographie erhaltene Signal selbst bei t0 unter jedem akzeptablen Standard und sank nach 15-minütiger Inkubation auf kaum oder nicht mehr nachweisbare Werte (Abb. 4a und S5). Umgekehrt waren die pDOC-Analysen unter allen drei Bedingungen aussagekräftig (Abb. 4b). Wir konnten echte Signale von 4- und 10-fach verdünntem Flag-Securin-GFP sowohl bei t0 als auch bei t60 min erkennen und die volle Dynamik des Proteins in mitotischen NDB-Extrakten aufzeichnen. Praktischer betrachtet haben wir effektiv gezeigt, dass der Proteinabbau mit 0,1 µl IVT-Produkt und 2 µl Zellextrakten analysiert werden kann, wodurch 90 % der Reagenzien eingespart werden können. Diese Funktion ist besonders wertvoll bei Tests, die auf begrenztem biologischem Material basieren, z. B. Extrakten aus Primärzellen und normalen/pathologischen Gewebeproben.

ein zeitabhängiger Abbautest von 35S-markiertem Flag-Securin-GFP in mitotischen NDB-Extrakten. Die Tests wurden mit unverdünntem IVT-Produkt (100 %) oder nach 4-facher/10-facher Verdünnung in Retikulozyten-Lysat (25 bzw. 10 %) durchgeführt. In allen Tests wurde 1 µl Substrat in 20 µl Zellextrakten inkubiert. Die Proben wurden in 20-Minuten-Intervallen eingefroren und mittels SDS-PAGE und Autoradiographie untersucht. b Äquivalente Abbautests, durchgeführt mit nicht radioaktivem Flag-Securin-GFP. Zur Immobilisierung (mittels anti-GFP-biotinyliertem Antikörper) und Nachweis (GFP-Fluoreszenz) wurden zeitpunktbezogene Proben auf den Chip geladen. Die Diagramme fassen Daten aus drei Experimenten zusammen, 15–20 Zelleinheiten pro Experiment. Normalisierte Mittel- und Standardfehlerwerte werden angezeigt (links). Auf der rechten Seite werden repräsentative Rohdaten angezeigt.

pDOC enthüllt eine remanente Menge an Flag-Securin-GFP, die mit herkömmlichen Methoden nicht sichtbar gemacht werden konnte. Obwohl das allgemeine Abbaumuster von Flag-Securin-GFP unter allen drei Bedingungen ähnlich war, stellten wir interessanterweise eine systematische Verzögerung des Flag-Securin-GFP-Abbaus fest, als die Substratkonzentration verringert wurde. Diese Beobachtung wurde bisher in unserem Labor nicht identifiziert und könnte auf geschwindigkeitsbegrenzende Schritte im Prozess der Ubiquitinierung/des Abbaus von Securin und möglicherweise APC/C-Substraten insgesamt zurückgeführt werden39,40. Beachten Sie, dass die geschätzte Konzentration von Flag-Securin-GFP im Reaktionsgemisch 17 nM betrug (vor weiterer Verdünnung im Retikulozytenlysat; Abb. S6).

Bisher haben wir die Fähigkeit von pDOC gezeigt, die Analyse von Proteinabbaureaktionen zu erleichtern, die im Röhrchen, also außerhalb des Chips, durchgeführt wurden (Abb. 2–4). Technisch gesehen ermöglichen Hals- und MITOMI-Knopfventile jedoch eine zeitgesteuerte Mischung zwischen dem Zielprotein und zellfreien Extrakten innerhalb jeder Zelleinheit. Genauer gesagt werden die Beladung und Immobilisierung von Zielproteinen mit geschlossenen Halsventilen durchgeführt. Sobald die Zielproteine ​​unter geschlossenen MITOMI-Knöpfen gefangen sind, können Zellextrakte in den Chip eingeflogen werden. Dieser Schritt wird mit offenen Halsventilen durchgeführt, sodass Zellextrakte in Kammer I gelangen können. Zellextrakte können dann in Kammer I, hier als „Extraktkammer“ bezeichnet, eingeschlossen werden, indem das Halsventil wieder geschlossen wird, und alle verbleibenden Materialien werden dann weggespült. Die Abbaureaktion beginnt (t0) mit dem Öffnen beider Hals- und MITOMI-Knopfventile. Zellextrakte diffundieren in die Proteinkammer und erreichen das freigelegte Zielprotein (dargestellt in Abb. 5a). Potenziell ermöglicht diese Pipeline einen vollständigen On-Chip-Assay für den Proteinabbau. Die Motivation für einen On-Chip-Assay ist dreifach: 1) Reagenzieneinsparung und Kosten pro Assay. Tatsächlich reichen 5 μl Zellextrakte aus, um tausend Zelleinheiten zu füllen; 2) Analyse des Proteinabbaus in Echtzeit. 3) höherer Durchsatz, insbesondere wenn die Zielproteine ​​auf dem Chip exprimiert werden, wie bereits zuvor gezeigt wurde25,26,27. Die Herausforderung besteht jedoch in der begrenzten Abbaukapazität von <1 nl Extrakten pro Zelleinheit, die noch nie auf einer Plattform getestet wurde. Wir haben beschlossen, die Machbarkeit des Proteinabbaus auf dem Chip zu testen. Zu diesem Zweck wurden wt- und nicht abbaubare Varianten von Flag-Securin-GFP sowie Flag-p27-GFP (IVT-Produkte) auf den Chip geladen (über separate Kanäle) und mittels Biotinylierung in Proteinkammern unter dem MITOMI-Knopfventil eingefangen Anti-GFP-Antikörper. Nach dem Waschen wurden mitotische NDB-Extrakte in die Extraktkammer geladen und durch Schließen des Halsventils eingefangen. Nicht eingeschlossene Materialien wurden weggespült. Das Gerät wurde auf 30 °C erhitzt und gescannt, um Signale von t0 zu erhalten. Das Öffnen des Halses und des MITOMI-Knopfventils löste gleichzeitig Abbaureaktionen in allen Zelleinheiten aus (Abb. 5a, b), und der Chip wurde in Zeitintervallen von 15 Minuten gescannt. Während das Fluoreszenzsignal von nicht abbaubarem Securin, p27, sowie von GFP selbst (Abb. S7) in mitotischen NDB-Extrakten während des gesamten Experiments stabil blieb, nahm das Signal von Flag-Securin-GFP mit der Zeit ab (Abb. 5c). Aufdeckung der regulierten Proteolyse dieses Proteins in einer mitotischen Umgebung.

a, b Schematische Darstellung des vollständigen On-Chip-Abbauassays durch pDOC. IVT-Proteinprodukte werden über biotinylierte Anti-GFP-Antikörper an der Oberfläche der „Proteinkammer“ immobilisiert (weitere Informationen finden Sie in Abb. 1). Das Schließen des MITOMI-Knopfventils fängt das Protein ein. Alle Reste werden mit PBS weggewaschen. Die ordnungsgemäße Expression und Immobilisierung der Zielproteine ​​wird durch Scannen validiert. Anschließend werden zellfreie Extrakte in die Extraktkammer geladen und durch Schließen des Halsventils eingefangen. Die Reaktion beginnt mit dem Öffnen der Hals- und MITOMI-Knopfventile, was die Diffusion von Zellextrakten in die „Proteinkammer“ und die Vermischung mit dem Zielprotein ermöglicht. Der Chip wird auf eine 30 °C heiße Platte gelegt und in 15-Minuten-Intervallen gescannt, um kinetische Informationen in Echtzeit bereitzustellen. c GFP-markierte Securin- und p27-IVT-Produkte wurden über anti-GFP-biotinylierte Antikörper immobilisiert. Anschließend wurden die Extraktkammern mit mitotischen NDB-Extrakten gefüllt, die die Ubiquitinierung von Securin unterstützen, nicht jedoch seiner nicht abbaubaren Variante (Δ64) und p27 (Negativkontrolle zur Validierung der Assay-Spezifität). Der Proteinabbau wurde eine Stunde lang untersucht, wobei der Chip fünfmal gescannt wurde. Das Diagramm zeigt mittlere GFP-Signale normalisiert auf t0 und Standardfehlerbalken; n = 14–30 Zelleinheiten. Repräsentative Rohdaten für p27 und Securin sind rechts dargestellt.

Lysin ist der primäre Ort für die Ubiquitinierung und Dutzende anderer PTMs, die den Proteinabbau auf weniger einfache Weise regulieren können. Wir nutzten die Multiplexfähigkeit von pDOC und testeten den Beitrag von Lysinresten zum Gesamtabbau von Geminin in mitotischer Umgebung. Die cis-Elemente, die den Abbau von Geminin regulieren, befinden sich am N-Terminus des Proteins. Tatsächlich ist das an die ersten 110 Aminosäuren von Geminin (mAG-Geminin) gebundene, fluoreszierende Monomer Azami-Green (mAG) ein bekannter Marker für die APC/C-Aktivität in Zellen31,41. Wir konstruierten ein mit einer Flagge versehenes mAG-Geminin, das im Folgenden als „Geminin-degron“ bezeichnet wird, und generierten eine Reihe mutierter Varianten, in denen einzelne Lysinreste (K) durch Alaninreste (A) ersetzt wurden. Es wurde auch eine nicht abbaubare Variante konstruiert, bei der die Zerstörungsboxsequenz 23RxxL26,42 durch GxxV (Einzelaminosäurecode) ersetzt wurde (Abb. 6a). Der Abbau aller Varianten in mitotischen NDB-Extrakten wurde zunächst auf dem Chip getestet (weitere technische Details siehe Abb. 5). IVT-Produkte wurden über biotinylierte Anti-Flag-Antikörper auf dem Chip immobilisiert und durch mAG-Fluoreszenz bei t0 und t60 min quantifiziert. Das Signalverhältnis zwischen diesen Zeitpunkten wurde zwischen 0 und 1 normalisiert, dh das Verhältnis, das für wt (0) und nicht abbaubare (1) Geminin-Degrons berechnet wurde (Abb. 6b). Als nächstes wurde eine Untergruppe mutierter Varianten Abbaureaktionen außerhalb des Chips unterzogen, gefolgt von einer Analyse auf dem Chip (Abb. 6c; weitere technische Details siehe Abb. 2). In beiden Endpunkttests wurde ein ähnlicher Abbautrend beobachtet (Abb. 6d). Beachten Sie, dass für die Signalquantifizierung und -normalisierung dieselbe Strategie verwendet wird. Wichtig ist, dass die beiden Tests eine begrenzte Abbaukapazität für die K50A-Variante in mitotischen NDB-Extrakten zeigten. Die teilweise Stabilität der K50A-Variante wurde durch zeitabhängige Abbauanalyse weiter validiert (Abb. 6e). Zu diesem Zweck wurden alle 20 Minuten Proben der Abbaureaktionen im Röhrchen entnommen und auf dem Chip analysiert. Interessanterweise konnte der begrenzte Abbau oder die K50A-Variante durch SDS-PAGE und Autoradiographie nicht nachgewiesen werden (Abb. 6f und S8). Diese Diskrepanz kann durch die unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Methoden und die Fähigkeit von pDOC, geringere Substratmengen nachzuweisen, erklärt werden (Abb. 4). Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass Lysin 50 zum Abbau von Geminin beiträgt. Derzeit ist unklar, ob Lysin 50 polyubiquitiniert ist. Aber wenn wir diesem Modell folgen würden, ist die Ubiquitinierung von Geminin eindeutig nicht auf Lysin 50 beschränkt, sonst wäre die K50A-Variante in mitotischen NDB-Extrakten stabil geblieben. Allgemeiner gesagt zeigen die in Abb. 6 dargestellten Daten eine systematische Analyse des Proteinabbaus durch pDOC.

a Eine Illustration von Geminin-degron, getaggt mit Flag und mAG. Lysine und das Kernelement (RxxL) der Zerstörungsbox (D-Box) werden durch einen einbuchstabigen Aminosäurecode angegeben. Mutantenvarianten wurden durch den Ersatz einzelner Lysinreste durch Alanin erzeugt. Die D-Box-Mutante (DBM) Geminin trägt Glycin und Valin an den Positionen 23 bzw. 26. b Endpunkt-Degradationsanalyse von Geminin-Degron-Varianten auf dem Chip. Die gestrichelte Linie stellt einen Grenzwert dar (dh vier Standardabweichungen des Gewichtsgeminin-Degrons zum Zeitpunkt t0), oberhalb dessen Varianten für weitere Analysen markiert wurden. c Endpunktdegradationsanalyse ausgewählter Geminin-Degron-Varianten. Abbaureaktionen wurden in Röhrchen durchgeführt und die Proteingehalte wurden auf dem Chip quantifiziert (technische Details siehe Abb. 2). b, c Normalisierte Niveaus von Geminin-Degron-Varianten bei t60 min werden aufgetragen. n = 12–38 (b) und 21–57 (c) Zelleinheiten. d Eine lineare Korrelation zwischen den in B und C dargestellten Daten. Es werden Mittel- und Standardfehlerwerte angezeigt. e, f Zeitabhängige Degradationen von Geminin-Degron-Varianten (im Röhrchen) wurden auf dem Chip (e; n = 16–25 Zelleinheiten) durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert (f; repräsentative Rohdaten sind links dargestellt; n = 3). Alle Abbaureaktionen finden in mitotischen NDB-Extrakten statt.

pDOC ist eine Lab-on-Chip-Plattform, die entwickelt wurde, um die Entdeckung und Analyse des Proteinabbaus in physiologisch relevanten Zusammenhängen zu erleichtern und zu vereinfachen. Der Chip beherbergt Hunderte von Mikrokammern, in denen der Proteinabbau zeitnah und gleichzeitig untersucht werden kann. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die Motivation und der Bedarf für pDOC weit über sein Hochdurchsatzpotenzial hinausgehen: 1) Analysen können im Vergleich zu herkömmlichen Assays mit erheblich geringeren Mengen an Reagenzien durchgeführt werden. Letzteres Merkmal ist besonders wichtig für zellfreie Extrakte, deren Produktion einen Engpass in Bezug auf Zeit, Aktivität und Menge darstellen kann, z. B. Zellextrakte, deren Ursprung wertvolle normale/bösartige Gewebeproben für die globale/persönliche biomedizinische Forschung sind. Diagnostik; 2) Die Signalerkennung basiert auf der In-situ-Quantifizierung des Fluoreszenzsignals. Die Methode ist unabhängig von kontaminierenden radioaktiven Materialien und weist dennoch eine Empfindlichkeit auf, die die herkömmlicher Tests übertrifft. Ein Vergleich zwischen pDOC und dem herkömmlichen Abbautest ist in Abb. 7 dargestellt. Die Flexibilität von pDOC ist erheblich. Die Plattform ermöglicht nahezu alle möglichen experimentellen Designs. Erstens können sowohl markierte als auch nicht markierte Proteine ​​untersucht werden, wobei der Nachweis auf dem Einbau von Green-Lys, fluoreszierenden Proteinen oder immunnachweisbaren Tags basiert. Zweitens kann pDOC als integrierte Mikrofluidiksäule für sofortige Analysen von Off-Chip-Abbaureaktionen mit geringem Volumen verwendet werden (Abb. 2–3). Die Integration zweier Lademodule ermöglicht das gleichzeitige Laden Dutzender Reaktionslösungen auf den Chip. Zielproteine ​​werden gereinigt und in der Proteinkammer der Zelleinheiten konzentriert, was die On-Chip-Erkennung des Off-Chip-Abbaus innerhalb von Minuten bis 1 Stunde (je nach Detektionsprotokoll) ermöglicht. Alternativ kann der Proteinabbau vollständig auf dem Chip und in Echtzeit untersucht werden. Dieses Merkmal von pDOC ist nicht nur wegen der Fähigkeit, den Proteinabbau im Sub-Nanoliter-Volumen zu testen, wichtig, sondern auch wegen der inhärenten Kompatibilität von MITOMI-basierten Geräten mit der On-Chip-In-vitro-Translation24,25,27. Durch die Expression einer Reihe von Proteinen auf dem Chip kann man Zielproteine ​​von Dutzenden bis Hunderten multiplexen, was den Durchsatz drastisch erhöht. Der Nachteil der On-Chip-Expression besteht darin, dass der Zusammenbau des Geräts mit dem DNA-Mikroarray nicht trivial ist und derzeit von Experten in spezialisierten Labors durchgeführt werden muss. Insgesamt ist der Multiplex-Charakter von pDOC bilateral: Eine Reaktionslösung kann auf Dutzende oder Hunderte verschiedener Proteine ​​angewendet werden, oder ein oder mehrere Proteine ​​können gleichzeitig unter mehreren physiochemischen Bedingungen auf Abbau getestet werden. Diese Qualität ist für die Analyse von Abbaureaktionen sowohl auf dem Chip als auch außerhalb des Chips relevant.

Der Zweck aller Methoden besteht darin, den Proteinabbau von IVT-Proteinprodukten in einem Reaktionsgemisch zu testen, das zellfreie Extrakte, rekombinantes Ubiquitin und ein Energie-Regenerationsgemisch (E.-Gemisch) umfasst. Der Standardtest (rote Pipeline) ist typischerweise radioaktiv. Ein 35S-markiertes IVT-Produkt (1–2 µl) wird mit 20–50 µl Reaktionsgemisch gemischt und 30–90 Minuten lang inkubiert. Zu jedem Zeitpunkt wird ein Aliquot (~5 µl) der Reaktionsmischung geerntet. Proben werden durch SDS-PAGE denaturiert und aufgelöst. Nach dem Trocknen wird das Gel einem Leuchtstoffschirm ausgesetzt. Normalerweise wird über Nacht (EIN) ein zufriedenstellendes Signal erhalten. Aus verschiedenen Gründen sind häufig längere Expositionen (24–72 Stunden) erforderlich, wenn das radioaktive Signal niedrig ist. pDOC bietet zwei alternative Tests (blaue Pipelines), beide mit Vorteilen. Strategie I: Abbaureaktionen werden außerhalb des Chips durchgeführt. Das Zielprotein wird entweder an einen Standard-Tag (z. B. GFP, Flag, Myc usw.) fusioniert oder in Gegenwart von Green-Lys translatiert. Zeitpunktproben werden entweder nacheinander auf den Chip geladen oder zuerst gekocht/eingefroren und dann gleichzeitig geladen. Das Zielprotein wird durch tag-/proteinspezifische Oberflächenantikörper immobilisiert, alle anderen Materialien werden weggewaschen und die Quantifizierung erfolgt nahezu augenblicklich mit einer der in Abb. 1c beschriebenen Strategien. Strategie II: Dabei werden Zielproteine ​​und Zellextrakte nacheinander auf den Chip geladen und belegen separate Kammern innerhalb jeder Zelleinheit. Die Vermischung der beiden Kampfkünste löst die Reaktion aus. Zeitraffer-Scans liefern kinetische Informationen. Während Strategie I einfacher ist, eignet sich Strategie II optimaler für Experimente mit hohem Durchsatz. Beide On-Chip-Strategien sind reagenziensparend und deutlich kürzer als der Standardassay.

Die Ubiquitin-vermittelte Proteolyse wird routinemäßig in Hunderten von Labors weltweit untersucht. Darüber hinaus ist es ein wichtiger Signalweg für Therapie (z. B. Velcade®) und Arzneimitteldesign (z. B. Nurix Therapeutics). Wir haben pDOC entwickelt, um In-vitro-Analysen des Proteinabbaus in quasizellulären Umgebungen zu erleichtern und zu vereinfachen. Die Methode ist schnell, empfindlich, reagenzsparend und eignet sich sowohl für Studien mit niedrigem als auch mit hohem Durchsatz. Bemerkenswert ist auch, dass eine vollständige Automatisierung der Plattform absehbar ist. Wir glauben daher, dass pDOC ein wertvolles Werkzeug für die Grundlagenforschung und die translationale Forschung zum gezielten Proteinabbau ist.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Quelldaten für Abbildungen und ergänzende Abbildungen werden in zwei XLSX-Dateien bereitgestellt: Ergänzende Daten 1 (Abbildungen) und Ergänzende Daten 2 (Ergänzende Abbildungen).

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Wir danken den Labormitgliedern von Gerber und Tzur für die Weitergabe der Reagenzien. Das Tzur-Labor wird von der Israel Science Foundation (ISF) Grant No. unterstützt. 2038/19. Das Gerber-Labor wird durch den Imageomics FET European Grant Nr. 205761 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lev Brio, Danit Wasserman.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Doron Gerber, Amit Tzur.

Die Mina & Everard Goodman Faculty of Life Sciences und das Institute for Nanotechnology and Advanced Materials, Bar Ilan University, Ramat Gan, Israel

Lev Brio, Danit Wasserman, Efrat Michaely-Barbiro, Gal Barazany-Gal, Doron Gerber und Amit Tzur

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Von LB, DW, EMB, DG und AT konzipierte Forschung; LB, DW und EMB führten Untersuchungen durch; LB, DW, EMB, GBG, DG und AT steuerten neue Reagenzien oder Analysewerkzeuge bei; LB, DW und EMB analysierten Daten; DW, LB, EMB, DG und AT haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Doron Gerber oder Amit Tzur.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Alle Autoren haben allen Manuskriptinhalten, der Autorenliste und deren Reihenfolge sowie den Autorenbeitragserklärungen zugestimmt.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Brio, L., Wasserman, D., Michaely-Barbiro, E. et al. Affinitätsmikrofluidik ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse des Proteinabbaus in zellfreien Extrakten. Commun Biol 5, 1147 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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Eingegangen: 27. August 2021

Angenommen: 12. Oktober 2022

Veröffentlicht: 28. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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