Oberflächenproteinprofilierung der Prostata - Beijing Epoxy Resin Co., Ltd

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1402 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Mediatoren der interzellulären Kommunikation und eine vielversprechende Klasse von Biomarkern. Oberflächenproteine von Elektrofahrzeugen spielen eine entscheidende Rolle beim Aufbau einer Verbindung mit Empfängerzellen und sind mutmaßliche Ziele für diagnostische Tests. Die Analyse der Oberflächenproteine kann somit sowohl die biologischen Funktionen von Elektrofahrzeugen beleuchten als auch zur Identifizierung potenzieller Biomarker beitragen. Wir haben eine Strategie entwickelt, die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) und Proximity-Ligation-Assays (PLA) kombiniert, um zunächst auf Elektrofahrzeugen entdeckte Oberflächenproteine zu identifizieren und dann zu validieren. Wir haben unseren Workflow angewendet, um Oberflächenproteine kleiner EVs in der Samenflüssigkeit (SF-sEV) zu untersuchen. Wir identifizierten 1.014 Oberflächenproteine und verifizierten das Vorhandensein einer Untergruppe davon auf der Oberfläche von SF-sEVs. Unsere Arbeit zeigt eine allgemeine Strategie für die tiefgreifende Analyse der Oberflächenproteine von Elektrofahrzeugen bei Patienten und pathologischen Zuständen, angefangen vom unvoreingenommenen Screening durch HRMS bis hin zu hochempfindlichen gezielten Analysen über PLA.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind doppelschichtige Lipid-Nanopartikel, die von den meisten Zellen abgesondert werden. Es gibt drei Hauptuntergruppen von EVs, die nach ihrer Größe, Biogenese und Dichte klassifiziert werden: (i) Exosomen, (ii) Mikrovesikel und (iii) apoptotische Körper. Exosomen sind kleine EVs (sEVs) mit einer Größe zwischen 30 und 150 nm, die durch das Einwärtsknospen von Endosomen entstehen, was zur Produktion von multivesikulären Körpern (MVBs) führt. MVBs verschmelzen schließlich mit der Plasmamembran und geben ihren sEV-Gehalt in die extrazelluläre Matrix sowie in Körperflüssigkeiten ab, wo sEVs nachweislich eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation spielen1,2,3,4,5. Mikrovesikel mit einer Größe von 100–800 nm und apoptotische Körper mit einer Größe von 200 nm–5 μm werden direkt von den Plasmamembranen lebensfähiger bzw. programmierter Zelltodzellen abgeschieden6. sEVs sowie Mikrovesikel und apoptotische Körper können den interzellulären Transport für die Lieferung molekularer Frachten vermitteln, die Proteine, Lipide, kleine RNAs und andere RNA-Spezies sowie genomische DNA-Fragmente enthalten1,7,8.

Aktuelle Studien haben gezeigt, dass der Inhalt von Elektrofahrzeugen je nach zellulärer Abstammung unterschiedlich ist und dass sie somit die Zellen widerspiegeln, aus denen sie stammen. Die Analyse der dynamischen Variation von sEV-Fingerabdrücken kann ein wertvolles Mittel zur Verfolgung und Überwachung von Krankheiten sein9,10,11,12,13. Aktuelle molekulare Studien und Tests, die sich auf zirkulierende Biomarker konzentrieren, bewerten hauptsächlich den RNA- und Lipidgehalt zirkulierender sEVs, es besteht jedoch ein zunehmendes Interesse, auch die Proteinzusammensetzung von sEVs3 zu untersuchen. Insbesondere die Oberflächenproteine von Elektrofahrzeugen sind aufgrund ihrer Rolle bei der Herstellung des Kontakts mit Zielzellen von großem Interesse, was zu ihrer zellulären Aufnahme oder Fusion mit der Plasmamembran führen kann, bevor ihre molekularen Ladungen freigesetzt werden14.

Samenflüssigkeits-sEVs (SF-sEV), auch Prostasomen genannt, werden von der Prostatadrüse in die Samenflüssigkeit abgesondert, wo eine ihrer Schlüsselfunktionen darin besteht, direkt mit den Samenzellen zu interagieren und sie zu schützen15,16,17. Die Fusion von SF-sEVs mit der Spermienplasmamembran ist für die Regulierung verschiedener Aspekte der Spermienzellfunktion erforderlich, wie z. B. Motilität und Kapazität, einer der letzten Schritte bei der Reifung von Spermien, die für den Erwerb der Befruchtungskapazität erforderlich sind18,19. SF-sEVs sind auch an der Interaktion zwischen Prostatakrebszellen und ihrer Mikroumgebung beteiligt20. Sie gelten als potenzielle Biomarker für männliche Unfruchtbarkeit21 und Prostatakrebs22,23, doch ist wenig über die zellulären Mechanismen bekannt, die ihre Produktion steuern, und über die molekularen Wege, die die SF-sEV-Funktionen steuern.

Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende Proteinanalyse ist ein effizientes und weit verbreitetes Instrument zur Charakterisierung von EV-Proteinen24,25. Von MS generierte Daten haben zur Entwicklung von Online-Datenbanken wie ExoCarta (www.exocarta.org)26 und Vesiclepedia (www.microvesicles.org) beigetragen, in denen Proteine aufgeführt sind, die in Elektrofahrzeugen, einschließlich sEVs, vorkommen27. Für die MS-basierte Analyse von Membranproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs wurden mehrere biochemische Techniken angewendet28. Insbesondere nicht membrandurchlässige Reagenzien für die chemische Derivatisierung, wie Sulfo-NHS-SS-Biotin, wurden eingesetzt, um sowohl Zelloberflächenproteine29 als auch EV-Oberflächenproteine von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen30 und der HMC-1-Mastzelllinie31 zu untersuchen.

MS-basierte Strategien allein können jedoch nicht die korrekte Lokalisierung und Ausrichtung von Proteinen auf den Oberflächen von Elektrofahrzeugen ermitteln. Daher sind häufig weitere Validierungsexperimente mit orthogonalen Methoden32,33 erforderlich, beispielsweise Immunaffinitätsmethoden gekoppelt mit Elektronen- und Superauflösungsmikroskopie34,35,36,37. Im Allgemeinen werden Enzymimmunoassays (ELISA) und andere affinitätsbasierte Tests verwendet, um bekannte Oberflächenmoleküle auf intakten Elektrofahrzeugen nachzuweisen. Allerdings eignen sich diese Methoden nicht für umfassende und multiple Untersuchungen von Oberflächenproteinen, da pro Assay nur zwei Zielproteine abgefragt werden können und die Ergebnisse durch unspezifische Bindung und Kreuzreaktivität beeinträchtigt werden können. Obwohl Antikörper-Arrays in jüngster Zeit in unterschiedlichen Formaten zum Nachweis großer Mengen EV-assoziierter Proteine38,39,40 eingesetzt wurden, sind sie aufgrund des begrenzten Spektrums der Antigenerkennung nicht für die unvoreingenommene Entdeckung biologisch und klinisch relevanter EV-Proteine geeignet. trotz ihrer Multiplexkapazität und ihres geringen Probenbedarfs.

In dieser Studie haben wir einen Arbeitsablauf für die Entdeckung und Validierung unbekannter EV-Oberflächenproteine entwickelt, indem wir hochauflösende MS (HRMS)-Analyse von Biotin-derivatisierten Oberflächenproteinen mit durchflusszytometriebasierten Proximity-Ligation-Assays (Exo-PLA) und/oder kombinierten Festphasen-Proximity-Ligationsassays (SP-PLA) (Abb. 1). Die Durchflusszytometrie ist eine robuste Technik zur Messung von Oberflächenzellmarkern und ein Werkzeug, das routinemäßig zur Zellprofilierung in der klinischen Praxis eingesetzt wird41,42. Diese Technik eignet sich auch für Analysen von Perlenanordnungen43,44. Die Möglichkeit, die Subpopulationen von EVs zu unterscheiden, macht die Durchflusszytometrie für die Untersuchung von sEVs besonders attraktiv; Aufgrund ihrer geringen Größe und der geringen Anzahl an Oberflächenmolekülen sind die Einsatzmöglichkeiten der konventionellen Durchflusszytometrie jedoch weiterhin begrenzt. Der Einsatz von Exo-PLA, einer mehrfarbigen Erkennungs- und Signalverstärkungstechnologie, ermöglicht es, die Größen- und Signalbeschränkungen für die durchflusszytometrische Analyse von sEVs zu überwinden. Durch die Nutzung der lokalen Signalverstärkung mittels Rolling Circle Amplification (RCA) werden tatsächlich einzelne sEVs weit oberhalb des durchflusszytometrischen Grenzwerts nachweisbar. Durch die Verwendung verschiedener Affinitätsbinder, wie z. B. Antikörper, und mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe können dann verschiedene Subpopulationen von sEVs sichtbar gemacht und gezählt werden45,46. SP-PLA basiert auf der Erkennung des Ziels durch kombinierte Sätze von drei Antikörpern mit Auslesungen über Echtzeit-PCR, was eine hervorragende Empfindlichkeit und Spezifität für den Nachweis von sEVs in Lösung bietet23.

a-SEVs wurden aus menschlichen Samenflüssigkeiten bzw. PC3-Kulturmedien isoliert und mit Sulfo-NHS-SS-Biotin behandelt, um äußere Membranproteine auf der Oberfläche der sEVs zu biotinylieren, bevor Lysepuffer hinzugefügt wurde. Biotinylierte Oberflächenproteine wurden auf Streptavidin-Kügelchen eingefangen und durch DTT freigesetzt. b Gesamt-, Gesamt-Minus-Oberflächen- und Oberflächenproteine wurden verdaut und durch markierungsfreie semiquantitative HRMS-Analyse identifiziert. c Das Vorhandensein dieser Proteine wurde durch Exo-PLA und SP-PLA validiert.

Wir haben diesen Workflow angewendet, um SF-sEVs als wesentliche Determinanten der männlichen Fruchtbarkeit und potenzielle Krebsbiomarker zu untersuchen. In dieser Studie wollten wir unser aktuelles Wissen über Oberflächenproteine von SF-sEVs erweitern und so ihre biologische Rolle bewerten sowie SF-sEVs auf molekularer Ebene für diagnostische Zwecke identifizieren und klassifizieren.

SEVs aus menschlicher Samenflüssigkeit (SF-EVs) und aus der Prostatakrebszelllinie PC3 wurden gemäß optimierten Protokollen gereinigt, die zu jeder Matrix passten47. Das Verfahren umfasste eine Kombination aus Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie und Saccharosegradiententrennung. Die Qualität der gereinigten Vesikel wurde mittels Negativfärbungs-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Western Blot und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) gemäß den Empfehlungen der Minimal Information for Studies of Extrazellulären Vesikeln (MISEV) 2018-Richtlinien48 untersucht. Negative EM-Färbung zeigte strukturell intakte SF-sEVs und PC3-sEVs (Abb. 2a). Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um das Vorhandensein der sEV-Marker CD9, CD63, CD81 und des Tumor-Susceptibility-Gen-101-Proteins (TSG-101) sowie das Fehlen des endoplasmatischen Retikulum (ER)-Markers Calnexin nachzuweisen, was auf die Reinheit der sEV-Proben hinweist Proteinkontaminationen (Abb. 2b). NTA ergab einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 190 und 160 nm für SF-sEVs (d. h. aus Samenflüssigkeit) bzw. PC3-sEVs mit einer mittleren Konzentration von 1,3 × 109 Partikeln/ml bzw. 1,4 × 109 Partikeln/ml (Abb . 2c).

a Negativ gefärbtes EM von SF-sEVs und PC3-sEVs. b Western-Blot-Ergebnisse für die sEV-Marker TSG-101, CD63, CD81 und CD9. Als Negativkontrolle diente der ER-Marker Calnexin. c NTA-Analyse des Modenpartikeldurchmessers ergab Werte von 155,8 und 192,2 nm für SF-sEVs bzw. PC3-sEVs. d Die Qualität der Reinigung wurde durch Gelelektrophorese für PC3-sEVs und SF-sEVs Repl 2 und Repl 3 bewertet. A: Gesamt minus Oberflächenfraktion PC3 sEVs; B: Gesamter minus Oberflächenanteil SF-sEVs Repl 2; C: Gesamter minus Oberflächen-SF-sEVs-Anteil Repl 3; D: Oberflächen-SF-sEVs-Fraktion Repl 2; E: Oberflächen-SF-sEVs-Fraktion Repl 3; F: Oberflächenanteil PC3 sEVs.

Die Oberflächenproteine intakter SF-sEVs und PC3-sEVs wurden mit Sulfo-NHS-SS-Biotin markiert, einem membranundurchlässigen Reagenz, das mit primären Aminen reagiert30. Die aus dem Reinigungsprozess erhaltenen Fraktionen waren: (i) Protein im gesamten sEV-Lysat (Gesamt); (ii) aus sEV-Oberflächen isolierte Proteine (Oberfläche) und (iii) nach der Isolierung von Oberflächenproteinen verbleibende Überstandsproteine (Gesamt minus Oberfläche) (Abb. 1a und 2d). Proteine aus jeder Fraktion wurden durch Trypsin verdaut und durch HRMS analysiert (Abb. 1b). Als Kontrolle wurde ein gesamtes PC3-Zelllysat hergestellt und analysiert. Eine vollständige Liste der in allen Fraktionen für SF-sEV, PC3-sEVs und PC3-Zelllysat identifizierten Proteine finden Sie in den Zusatzdaten 1. Für alle in dieser Studie identifizierten Proteine enthält die Tabelle in den Zusatzdaten 1 Folgendes: 1- Genontologie ( GO) Anmerkung; 2- Lokalisierung; 3- Beteiligung an biologischen Prozessen und 4- molekulare Funktion, und wir stellen eine Anmerkung zu Gewebespezifität und -wegen bereit, indem wir Daten verwenden, die aus der UniProt Knowledgebase-Datenbank (UniProtKB) heruntergeladen wurden. Durch HRMS identifizierte isolierte Oberflächenproteine wurden mithilfe von Exo-PLA und SP-PLA auf den sEV-Oberflächen exprimiert (Abb. 1c). Die Qualität der sEV-Reinigung wurde durch Gelelektrophorese bewertet (Abb. 2d). Um die Robustheit unseres Arbeitsablaufs zu beurteilen, haben wir außerdem die SF-sEV-Proben in Replikaten vorbereitet und analysiert: (siehe „Methoden“, ergänzende Abbildung 1a – c und ergänzende Abbildung 2b – g). Das Protokoll zur Probenvorbereitung zeigte eine geringe Variabilität zwischen den Replikaten (7–19 %). Beim Vergleich technischer Replikate für dieselben biologischen Proben (Rep 2 und Rep 3) wurde festgestellt, dass 1086 von insgesamt 1364 Proteinen für die Gesamt-Minus-Oberfläche (ergänzende Abbildung 1b) und 653 von insgesamt 915 für die Oberfläche ( Ergänzende Abbildung 1c). Beim Vergleich technischer und biologischer Replikate hinsichtlich der gesamten Minusoberfläche wurden 41 gemeinsame Proteine für Rep 1 und Rep 2 und 64 gemeinsame Proteine zwischen Rep 1 und Rep 3 gefunden (ergänzende Abbildung 1b). Für Oberflächen-Rep 1 vs. Rep 2 wurden 46 gemeinsame Proteine identifiziert, während die Anzahl gemeinsamer Proteine für Rep 1 vs. Rep 3 31 betrug (ergänzende Abbildung 1c). Zwischen den Replikaten wurde eine hohe Korrelation zwischen der relativen Proteinhäufigkeit in normalisierten Peptidspektralübereinstimmungen (nPSMs) gefunden (Pearson's r: 0,84–0,99; ergänzende Abbildung 2).

Nach der Zusammenführung der in den Replikaten identifizierten Proteine führte die Analyse der Fraktionen Gesamtlysat, Oberfläche und Gesamtminusoberfläche zur Identifizierung von 1414, 1014 bzw. 1460 Proteinen (Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Daten 1 und Abbildung 3b). . Wie in Abb. 3 gezeigt, wurden in allen Proben 875 Proteine identifiziert, 381 Proteine waren zwischen Gesamtlysat und Gesamtminusoberfläche gemeinsam und 20 bzw. 39 Proteine waren zwischen Oberfläche und Gesamtminusoberfläche bzw. Gesamtlysat gemeinsam.

a Proteine, die durch MS-Analyse von SF-sEVs und PC3-sEVs identifiziert wurden, wurden mit den ExoCarta- und GO-Datenbanken verglichen. b Venn-Diagrammdarstellung der in den drei SF-sEVs-Fraktionen identifizierten Proteine. c Kreisdiagrammdarstellung der Kategorien der zellulären Komponenten der Genontologie (GO-CC) für Proteine, die an der Gesamt-Minus-Oberfläche angereichert sind. d GO-CC-Kategorien für Proteine, die an Oberflächenfraktionen angereichert sind. e Top-Ten-Begriffe, die durch funktionelle Annotationsanalyse in DAVID für Proteine erhalten wurden, die an Gesamt-Minus-Oberflächenfraktionen angereichert sind. f Die zehn wichtigsten in DAVID identifizierten Begriffe für Proteine, die in Oberflächenfraktionen angereichert sind. In die Analyse wurden nur Proteine einbezogen, die in mindestens zwei Proben identifiziert wurden.

Um eine semiquantitative Proteomikanalyse über alle Samenflüssigkeits- und PC3-sEVs-Fraktionen hinweg durchzuführen, wurde die Anzahl der mit jedem identifizierten Protein verbundenen Peptid-Spektralübereinstimmungen (PSMs) entsprechend der Gesamtzahl der in jeder Probe identifizierten PSMs normalisiert, um das nPSM zu erhalten . Zu den fünfzig am häufigsten vorkommenden Proteinen, die in der Oberflächenfraktion von SF-sEVs identifiziert wurden, gehörten Semenogelin-1 (SEMG1), Semenogelin-2 (SEMG2), Fibronektin (FN1), CD13, CD10, Fettsäuresynthase (FASN) und Kreatinkinase B ( CKB). SEMG1 und SEMG2 waren mit nPSM-Werten von 8,1 bzw. 5 besonders häufig (Tabelle 1 und ergänzende Daten 1). Unsere Analyse führte zur Identifizierung von 273 neuen mutmaßlichen sEV-Proteinen, die derzeit weder in der Exocarta-Datenbank noch im UniProtKB als sEV-Proteine aufgeführt sind (Abb. 3a). Die Identifizierung von Oberflächenproteinen mittels Proteinmarkierung mit Sulfo-NHS-SS-Biotin auf intakten sEVs gewährleistet keine 100-prozentige Effizienz bei der Extraktion von Oberflächenproteinen, und es ist mit einem gewissen Grad an Kontamination zwischen den Fraktionen zu rechnen. Um die am höchsten angereicherten Proteine in jeder Fraktion zu identifizieren, wurden daher Fold-Change-Rankings und T-Test-Statistiken verwendet. Als oberflächenangereichert wurden Proteine definiert, die in der Oberflächenfraktion eindeutig oder häufiger vorkommen als in der Gesamtminus-Oberflächenfraktion (Fold Change (FC) >2 und/oder P-Wert <0,05). Proteine, die im gesamten Minus-Oberflächenanteil im Vergleich zu denen im Oberflächenanteil angereichert waren, wurden als mit Ladung angereichert definiert. Die Analyse führte zur Identifizierung von 74 oberflächenangereicherten SF-sEV-Proteinen, von denen 43 gemäß der GO-Klassifizierung der Zellkomponenten als Membranproteine klassifiziert wurden (Ergänzungsdaten 1 und 2).

Die Funktionen und das Netzwerk von 74 oberflächenangereicherten Proteinen wurden mit STRING analysiert, einem Suchwerkzeug und einer biologischen Datenbank zum Nachweis von Genen/Proteinen und zur Vorhersage von Protein-Protein-Wechselwirkungen (https://string-db.org/). Die Proteine wurden anhand von sieben Kriterien analysiert: (1) Expression im Zytosol, (2) mutmaßliche Beteiligung an der Krankheitsentwicklung, (3) Rollen im Immunsystem, (4) mögliche Funktion im männlichen Fortpflanzungssystem, (5) Vorhandensein von Proteinen in EVs (6) Samenbläschen und (7) multivesikulärer Körper. Kurze Funktionsbeschreibungen für diese Proteine sind in den Ergänzenden Daten 3 aufgeführt und die Erfüllung eines oder mehrerer Kriterien für jedes Protein ist in der Ergänzenden Abbildung 3 dargestellt.

Die am stärksten angereicherten Proteine in der Oberflächenfraktion im Vergleich zur gesamten Minusoberfläche waren KRT2, DNAJC3 und CASP14 (Abb. 4a, b, Ergänzungsdaten 2; drei Replikate). Bekannte sEV-Marker unter den häufiger vorkommenden Proteinen in der Oberflächenfraktion von SF-sEVs waren ANPEP, FASN und CLU (Abb. 4c).

a Proteine, die in der Oberfläche und in den gesamten Minus-Oberflächenfraktionen identifiziert wurden, wurden durch Fold-Change- und T-Test-Statistikanalyse verglichen. a Das Balkendiagramm stellt das Verhältnis der 25 am stärksten angereicherten Proteine an der Oberfläche und insgesamt abzüglich der Oberflächenanteile dar. b Das Vulkandiagramm stellt Faltungsänderungen und P-Werte für Proteine dar, die in mindestens zwei Proben identifiziert wurden. c Häufigkeit normalisierter Peptidspektrum-Übereinstimmungen (nPSMs) bekannter sEV-Marker in der Oberflächenfraktion von SF-sEVs.

Darüber hinaus analysierten wir die subzelluläre Lokalisierung, die molekulare Funktion und die GO-Begriffe des biologischen Prozesses für die Proteine, bei denen wir fanden, dass sie entweder an der Oberfläche oder mit Ladung angereichert sind (Ergänzungsdaten 1). Sowohl für SF-sEVs als auch für PC3-sEVs zeigte die subzelluläre Lokalisierungsanalyse eine starke Anreicherung von Proteinen, die als extrazellulär eingestuft wurden, unter Proteinen, die in der Oberflächenfraktion häufiger vorkommen. Mit der extrazellulären Region assoziierte Proteine machten 3% der Frachtfraktion aus, während bis zu 13% der Proteine in der Oberflächenfraktion als Oberflächenproteine annotiert wurden (Abb. 3c, d und ergänzende Abb. 4 und 5). In ähnlicher Weise ergab die Analyse der GO-Terme für molekulare Funktionen und biologische Prozesse unterschiedliche spezifische Merkmale für die Oberfläche und die Frachtproteine (ergänzende Abbildung 4), die durch die mithilfe der DAVID-Datenbank durchgeführte Funktionsannotationsanalyse zusammengefasst werden (Abb. 3e, f). ). Die funktionelle GO-Analyse ergab, dass die Begriffe „hoch angereichert“ für die Oberflächenfraktion „Kalziumbindung“ und „Zwischenfilament“ waren, während Zytoplasma und Acetylierung die wichtigsten Begriffe für die mit Ladung angereicherten Proteine waren. Die zehn wichtigsten biologischen Begriffe, die DAVID für jede GO-Kategorie erhalten hat, sind in der ergänzenden Abbildung 4 aufgeführt.

Das Vorhandensein der durch MS identifizierten Proteine auf der Oberfläche intakter SF-sEVs und PC3-sEVs wurde durch die Entwicklung spezifischer Exo-PLA- oder SP-PLA-Tests weiter untersucht. Exo-PLA visualisiert sEVs mithilfe mehrerer Paare von Antikörpersonden. Wenn beide Mitglieder eines Sondenpaares auf der Oberfläche der sEVs eng aneinander binden, kann physikalisch ein zirkulärer DNA-Strang erzeugt werden, der zu einem RCA-Produkt führt. Die wiederholten Sequenzen des RCA-Produkts werden dann mithilfe von Hybridisierungssonden sichtbar gemacht, mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Dieses leistungsstarke Tool ermöglicht die molekulare Differenzierung von sEV-Subpopulationen ausschließlich auf der Grundlage der Kombination von Proteinen, die auf ihrer Oberfläche exprimiert werden45. Die Gating-Strategie wird in der ergänzenden Abbildung 6a erläutert. Wir verwendeten eine Kombination von Exo-PLA-Sonden, die auf bekannte und stark exprimierte sEV-Marker abzielen, als Kontrollen und ausgewählte Ziele, die durch unsere HRMS-Analyse identifiziert wurden, um das Vorhandensein von SEMG1, saurer Prostataphosphatase (ACPP), prostataspezifischem Antigen (PSA) und Prostatakrebs zu bestätigen. spezifisches Membranantigen (PSMA), Prostaglandin D2 (PTGDS), CD59, A-Kinase-Ankerprotein (AKAP4), Cystein-reiches sekretorisches Protein 1 (CRISP1) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase testis-spezifisch (GAPDS) auf der Oberfläche von SF-sEVs und PC3-sEVs (Abb. 5a). Insbesondere identifizierten wir zwei unterschiedliche Subpopulationen von SF-sEVs, die SEMG1 entweder mit CD59 oder mit PSMA exprimierten, während bei PC3-sEVs die Expression von SEMG1 und CD59 weniger häufig vorkam. Eine Kombination von gegen SEMG1, PSMA und PTGDS gerichteten Exo-PLA-Sonden ergab doppelt und dreifach positive Populationen sowohl für SF-sEVs als auch für PC3-sEVs. Eine Kombination von gegen SEMG1, GAPDS und AKAP4 gerichteten Antikörperkonjugaten identifizierte doppelt und dreifach positive Populationen auf SF-sEVs, jedoch nicht auf PC3-sEVs (Abb. 5a) und bestätigte damit die MS-Daten, bei denen die höchste Häufigkeit von AKAP4 gefunden wurde in der Fraktion mit den Oberflächenproteinen von SF-sEV im Vergleich zu der von PC3-sEVs. Doppelt positive Populationen von SEMG1 und ACPP sowie SEMG1 und CRISP1 wurden auch sowohl in SF-sEVs als auch in PC3-sEVs gefunden; Allerdings scheinen dreifach positive Populationen in SF-sEVs viel seltener vorzukommen als die Population, die für SEMG1 zusammen mit PSMA und PTGDS oder SEMG1 mit AKAP4 und GAPDS positiv ist. Als zusätzliche Kontrolle für die verschiedenen Fluoreszenzsignale wurden die Proben auch mittels Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung fluoreszierender RCA-Produkte und zur endgültigen Validierung untersucht (ergänzende Abbildung 6b).

eine Kombination verschiedener Marker auf der Oberfläche von sEVs, die von Exo-PLA erkannt werden. Das Gating positiver Signale in der Durchflusszytometrie und verschiedene Populationen werden angezeigt. b SF-sEVs wurden von Perlen eingefangen, die mit Antikörpern für spezifische Ziele beschichtet waren, die durch HRMS-Analysen identifiziert wurden (CRISP1, AKAP4, GAPDS, SMG1 und PTGDS), für jedes Panel angegeben und mit PLA-Sonden gegen CD9- und CD26-Marker nachgewiesen. Der reichlich vorhandene Marker CD68 wurde als Fänger für die Positivkontrolle der Assay-Leistungen verwendet, der ER-Marker Calnexin wurde als Negativkontroll-Fängerantikörper verwendet. Die x-Achsen zeigen die Konzentration der Proben in ng Gesamtprotein pro ml. Die y-Achsen zeigen die Unterschiede zwischen dem Schwellenwertzyklus für die Echtzeit-PCR-Auslesung von SP-PLA-Reaktionen für die Proben und dem Schwellenwertzyklus der Negativkontrolle (Assay-Puffer ohne Proben). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar, jede Probe wurde dreifach getestet.

Das auf Immunaffinität basierende SP-PLA bietet die Möglichkeit, intakte sEVs zu erkennen und zu quantifizieren, indem es auf bis zu drei Oberflächenproteine abzielt. In dieser experimentellen Umgebung wurden SF-sEVs zunächst mithilfe von Antikörpern gegen eines der Zielproteine CRISP1, SEMG1, PTGDS, AKAP4 oder GAPS eingefangen. Die eingefangenen SF-sEVs wurden dann mithilfe eines Paars Oligonukleotid-konjugierter Antikörpersonden nachgewiesen, die gegen die bekannten Marker CD9 und CD26 gerichtet waren. Höhere Erkennungssignale wurden aufgezeichnet, wenn SF-sEVs von Antikörpern eingefangen wurden, die gegen CRISP1-, SEMG1- oder PTGDS-Antikörper gerichtet waren, im Vergleich zu SF-sEVs, die von Antikörpern gegen AKAP4 und GAPDS eingefangen wurden. Dennoch waren alle Ziele auf der Oberfläche von SF-sEVs zuverlässig nachweisbar (Abb. 5b). Wie erwartet lieferte ein Negativkontrollexperiment unter Verwendung eines Fängerantikörpers gegen den ER-Marker Calnexin selbst bei hohen Probenkonzentrationen nicht nachweisbare Signale (Abb. 5b). Die SP-PLA-Daten stimmten mit denen von Exo-PLA überein, was die Oberflächenexpression von Proteinen, die in HRMS-Analysen identifiziert wurden, weiter untermauert.

Informationen über die Identität von Proteinen, die auf der Membran von sEVs exprimiert werden, können für diagnostische und präparative Verfahren von Wert sein. In dieser Studie haben wir eine hochmoderne Strategie zur Untersuchung von Oberflächenproteinen von sEVs entwickelt, indem wir ein unvoreingenommenes Profiling mithilfe von HRMS mit Exo-PLA45 und SP-PLA49 kombinierten, um das Vorhandensein der identifizierten Proteine auf der Oberfläche intakter sEVs zu validieren . Durch die Verwendung eines unvoreingenommenen MS-Ansatzes konnten wir insgesamt 1730 Proteine in SF-sEVs und PC3-sEVs identifizieren, von denen 273 bisher nicht gemeldet wurden, und so eine Liste potenzieller Ziele für zukünftige Studien zu zirkulierenden SF-sEVs und anderen sEVs bereitstellen (Abb. 3a).

Die hier beschriebene Strategie bietet ein effizientes Mittel zur Untersuchung von Zelloberflächenproteinen sowie Oberflächenproteinen von Elektrofahrzeugen29. Dieser Ansatz diente zur Identifizierung von insgesamt 1014 mutmaßlichen Oberflächenproteinen auf SF-sEVs, wobei 457 Proteine in allen drei Replikatproben und 730 in mindestens zwei Replikaten gefunden wurden (ergänzende Abbildung 1). Von den 1014 Proteinen identifizierten unsere Daten 74 einzigartige Proteine, die im Vergleich zu den gesamten Minus-Oberflächenproteinfraktionen ausschließlich auf der Oberfläche von sEVs angereichert waren (Ergänzungsdaten 1 und 2). Proteine, die in mehr als einer Replikatprobe identifiziert wurden, die für jede Fraktion hergestellt wurde, stellen die aussagekräftigsten Entdeckungen und vernünftigerweise auch die am häufigsten vorkommenden Proteine in dieser Fraktion dar. Wir haben jedoch weiterhin die PLA-basierten Validierungsschritte für drei Proteine einbezogen, die in drei Replikatproben gefunden wurden (SEMGI, PTGDS und CRISP1), für eines, das in zwei Replikaten gefunden wurde (AKAP4), und für eines, das nur in einem Replikat gefunden wurde (GAPDS). ).

Von einem bestimmten Gewebe oder Zelltyp freigesetzte SEVs stellen eine heterogene Population von EVs50 dar. Tatsächlich wurde berichtet, dass Samen-SF-EVs aus mehreren verschiedenen Zelltypen im männlichen Fortpflanzungssystem stammen51,52 und möglicherweise zur heterogenen Proteinexpression sowie zu heterogenen Funktionen beitragen. Eine globale proteomische Analyse der Daten ergab, dass 74 Oberflächenproteine mit extrazellulären Proteinen von SF-sEVs angereichert waren (Ergänzungsdaten 2 und Abb. 3), was mit früheren Beobachtungen von Webber und Kollegen übereinstimmte53. Mithilfe eines SOMAscan-Arrays zur Proteinmessung zeigten die Autoren, dass Proteine, von denen angenommen wird, dass sie von der Prostata abgesondert werden, tatsächlich auf der Oberfläche von Elektrofahrzeugen vorhanden sein könnten. Unsere Daten, die sich auf die Bewertung von sEV-Oberflächenproteinen konzentrierten, untermauern daher die Hypothese, dass einige der in Bioflüssigkeiten gemessenen Proteine auch oder ausschließlich auf der Oberfläche von sEVs exponiert sein könnten.

Da die Genexpression und Proteinsynthese in Spermien vor dem Ende der Spermatogenese unterbrochen wird, wurde berichtet, dass Spermien einen Teil der für ihre volle Funktion erforderlichen Moleküle von SF-EVs erwerben, die nachweislich essentielle Proteine durch Fusion mit den übertragen Plasmamembran54. Die Kapazität der Spermien ist ein Prozess, bei dem die Ca2+-Signalübertragung von entscheidender Bedeutung ist. Wie von Park et al. vermutet, nutzen Spermien möglicherweise auch andere Mechanismen, an denen keine Ionenkanäle für die Ca2+-Signalübertragung beteiligt sind55. Solche Mechanismen können auf der Fusion der Spermienzellmembran mit SF-EVs beruhen, die Rezeptoren und Enzyme tragen, die für die Ca2+-Mobilisierung erforderlich sind. Es wurde zuvor gezeigt, dass die Übertragung von CD38 von SF-EV in das Sperma die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung vom Ryanodinrezeptor auslösen kann (53). In Übereinstimmung mit der Hypothese von Park deuten unsere Daten darauf hin, dass Proteine, die die Calciumionenbindung erleichtern, zu den am höchsten angereicherten Proteinen in der Oberflächenfraktion von SF-sEVs gehören (Abb. 3f und ergänzende Abb. 4). Fünf der 74 Proteine, die besonders angereichert auf der Oberfläche von SF-sEVs gefunden wurden, CRTAC1, AGRN, GAS6, NUCB2, NUCB1 und FLG2, sind auf GO als Calcium-bindende Proteine annotiert (Supplementary Data 1).

Die Identifizierung einer großen Anzahl von Proteinen in den SF-sEVs, von denen bekannt ist, dass sie auch im Zentralnervensystem exprimiert werden (Ergänzungsdaten 1) (z. B. Kinesin-Schwerketten-Isoform 5C (KIF5C), synaptisches Vesikelmembranprotein VAT-1 , 14-3-3 Protein Theta (YWHAQ), Brustkarzinom-amplifizierte Sequenz 1, Elongationsfaktor 1-alpha 1 (EEF1A1) und hirnsäurelösliches Protein 1 (BASP1)) oder das Vorhandensein von Proteinen, die in stark exprimiert werden Das neuroendokrine Prostataepithel (Prostata-Stammzellantigen (PSCA)) unterstützt den zuvor vermuteten neuroendokrinen Ursprung von SF-EVs und ihre bekannte potenzielle Wirkung als Neurotransmitter56,57. Proteine wie der CatSper-Rezeptor55, Chromogranin B und das Neuropeptid Y56 wurden in dieser Studie jedoch nicht identifiziert.

Eine Untergruppe der durch HRMS identifizierten Oberflächenproteine wurde zur Validierung mithilfe antikörperbasierter Methoden ausgewählt, die in der Lage sind, intakte sEVs über extern exponierte Oberflächenproteine nachzuweisen. PLA stellt einen einzigartigen und leistungsstarken molekularen Assay dar, der die Möglichkeit bietet, Proteinkombinationen nachzuweisen, indem sie mithilfe von zwei oder mehr Sonden, die aus an DNA-Oligonukleotide konjugierten Antikörpern bestehen, nebeneinander lokalisiert werden. Eine solche Sondenbindung in unmittelbarer Nähe kann DNA-Vorlagen für die Amplifikation durch PCR oder RCA und Signalamplifikation zur visuellen Erkennung/Bestätigung erzeugen. Eines der PLA-Formate, 4PLA, wurde erfolgreich eingesetzt, um erhöhte SF-sEV-Werte im Plasma von Patienten mit Prostatakrebs nachzuweisen23. Daher bietet die Kombination von Exo-PLA- und SP-PLA-Methoden ergänzende Informationen und die einzigartige Möglichkeit zur Identifizierung von Oberflächenproteinen, auf die diagnostische Tests abzielen können. Während der SP-PLA die Identifizierung von aus sEV-Subpopulationen gereinigten sEVs durch Identifizierung/Validierung der Proteinoberflächenzusammensetzung ermöglicht, bietet der Exo-PLA-Assay eine Empfindlichkeit für die Quantifizierung von sEVs aus Bioflüssigkeiten.

Mithilfe von Exo-PLA haben wir das Vorhandensein von SEMG1, ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, CRISP1 und GAPDS auf der Oberfläche von SF-sEVs und PC3-sEVs bestätigt. PSA, ACPP und PSMA sind für ihre Rolle in der Prostataphysiologie und als Biomarker für Prostatakrebs bekannt. Über das Vorhandensein von PSA auf der Oberfläche von SF-EVs wurde bereits berichtet58, wohingegen ACPP und PSMA, die in dieser Studie identifiziert wurden, integrale Membranproteine sind59 und PSMA nur in der Membran von Lysosomen60 identifiziert wurde. Weniger ist über SEMG1, AKAP4, CRISP1, GAPDS und PTGDS bekannt, von denen nach unserem besten Wissen bisher nicht berichtet wurde, dass sie auf der Oberfläche von SF-sEVs oder anderen sEVs lokalisiert sind.

Es ist bekannt, dass SEMG1 und 2 Hauptbestandteile des menschlichen Samenkoagulums und des Samenplasmas sind (20–40 % des Proteingehalts)61,62. Proteinexpressionsanalysen haben gezeigt, dass SEMG1 hauptsächlich im Drüsenepithel von Samenbläschen exprimiert wird und einige Studien haben ihre Expression in Prostatakrebszellen nachgewiesen63,64. Yang und Kollegen haben bereits gezeigt, dass diese Proteine integrale Bestandteile von SF-EVs sind25. SEMG 1 wurde im Komplex sowohl mit dem Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerten als auch mit dem löslichen CD52 gefunden, und es wurde die Hypothese aufgestellt, dass GPI-verankertes CD52 als Dock für SEMG1 bei der Verankerung der Spermien zur Bildung von Blutgerinnseln65 dient, die später durch PSA abgebaut werden ermöglichen die Beweglichkeit der Spermien. Aktuelle Studien fanden eine negative Korrelation zwischen der Spermienmotilität und dem Anteil SEMGs-gebundener Spermien66,67. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ungebundenes Sperma ein relevanter Parameter für die In-vivo-Fertilisation sein könnte68.

Obwohl bisher nicht bekannt war, dass GAPDS, AKAP4 und PTGDS auf der Oberfläche von SF-EVs exprimiert werden, wurden sie alle als mit der Oberfläche von Spermien assoziierte Proteine69,70 identifiziert, die beide an der Beweglichkeit der Spermien71,72 und der Befruchtung von Eizellen bei Säugetieren73 beteiligt sind . Es ist daher plausibel, dass SEMG1 und andere in unserer Studie identifizierte Proteine tatsächlich von Prostata- und Nebenhodenzellen auf die Oberfläche von Spermien übertragen werden, um zur Aktivierung und/oder Verbesserung ihrer physiologischen Funktion beizutragen.

Der Ansatz zur Isolierung von Oberflächenproteinen nach der Biotinmarkierung kann einige Einschränkungen aufweisen. Erstens kann die Effizienz der Biotinmarkierung, ein Prozess, der auf der Verfügbarkeit primärer Amine beruht, je nach Protein unterschiedlich sein. Zweitens kann eine Reinigung mit Streptavidin-beschichteten Perlen teilweise oder unvollständig sein, jedoch mit einheitlicher Darstellung, mit dem Risiko einer unspezifischen Bindung an die Perlen74,75,76. Dies könnte beispielsweise der Grund dafür sein, dass die allgemeinen sEV/SF-sEV-Marker wie PSMA1, CD9 und CD151 in allen analysierten Fraktionen (Oberfläche, Gesamt minus Oberfläche und Gesamtlysat) nachgewiesen, aber angereichert waren in den Oberflächenfraktionen (Abb. 4 und Zusatzdaten 1). Drittens können die identifizierten Oberflächenproteine einige absorbierende Schichtproteine umfassen, die als Proteinkorona bekannt sind und in Körperflüssigkeiten oder Kulturmedien vorhanden sind. Sie binden an die Oberfläche von Elektrofahrzeugen, wo sie eine bestimmte Funktion erfüllen oder bei der Untersuchung zu einer Quelle von Proteinkontaminationen werden können Membranproteine77,78.

Durch die Entwicklung dieses Assays demonstrieren wir die Machbarkeit der Messung von Oberflächenproteinen und insbesondere von SF-sEVs, die potenzielle Ziele für die Entwicklung neuer diagnostischer Assays und die Erkennung von Prostatakrebs darstellen könnten23. Unsere Analysen können die Grundlage für die Entwicklung diagnostischer Instrumente zur Beurteilung der männlichen Fruchtbarkeit bilden, indem sie ein molekulares Screening bereitstellen, das die Mechanismen untersucht, die erforderlich sind, damit Spermien voll funktionsfähig werden79. Unsere hier beschriebene Untersuchung von SF-sEVs-Oberflächenproteinen stellt einen Machbarkeitsnachweis für einen Arbeitsablauf dar, der die Leistung einer unvoreingenommenen MS-Proteomanalyse mit gezielten PLAs zur Identifizierung von SF-sEVs-Proteinen kombiniert, jedoch mit potenzieller Anwendung auf jede Art von Elektrofahrzeugen. SP-PLA bietet die einzigartige Möglichkeit, EVs mit hoher Sensitivität und Spezifität zu quantifizieren, während Exo-PLA mit individueller EV- und multiparametrischer Analyse das Potenzial hat, eine optimale Plattform zur Unterstützung einer tiefgreifenden Untersuchung der Rolle von Mutmaßlichen zu werden Oberflächenproteine bei Patienten und pathologischen Zuständen. Beide Tests haben das Potenzial, direkt auf klinische Anwendungen übertragbar zu sein.

Samenplasma wurde im Reproduktionszentrum des Universitätsklinikums Uppsala nach bestehenden Routinen und mit Genehmigung des Internal Review Board gesammelt8. Die beiden in dieser Studie analysierten anonymisierten SF-sEV-Proben (Proben 1 und 2) wurden jeweils durch Zusammenführen von Samenplasmaproben von fünf Personen gewonnen. Die Probenentnahme wurde von der Ethikkommission der Universität Uppsala (Ups 01-367) genehmigt und eine Einverständniserklärung eingeholt. Die SF-sEVs wurden unter Verwendung eines optimierten Protokolls zur Isolierung von sEVs aus Samenflüssigkeiten gereinigt80. Menschliches Samenplasma wurde 10 Minuten lang bei 3000 × g und dann 30 Minuten lang bei 4 °C bei 10.000 × g zentrifugiert, um Trümmer zu pelletieren. Anschließend erfolgte eine Ultrazentrifugation des Überstands bei 100.000 × g für 2 Stunden bei 4 °C. Das EV-haltige Pellet wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und durch Größenausschlusschromatographie auf einer mit Superdex 200-Gel gefüllten XK16/70-Säule (GE Healthcare) weiter gereinigt. Darauf folgte eine Dichtegradiententrennung, bei der die SF-sEVs im Dichtebereich von 1,13–1,19 g/ml gewonnen wurden. Die Konzentration der gereinigten SF-sEVs wurde mithilfe des Pierce BCA-Proteinassays (ThermoFischer Scientific) auf 2 mg/ml eingestellt und bis zur Verwendung bei –80 °C gehalten.

Die menschliche Prostatakrebszelllinie PC3 (ATCC-CRL1435) wurde in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glu, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Gibco, ThermoFisher Scientific, USA). Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–80 % kultiviert, das Medium wurde dann durch Medium mit 10 % EV-abgereichertem FBS (System Bioscience, Palo Alto, CA, USA) ersetzt und die Zellen wurden weitere 48 Stunden lang gezüchtet. Die Zellen wurden entfernt und konditionierte Medien durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 300 × g gesammelt. Die konditionierten Medien wurden durch 0,22-µm-Filter (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA) geleitet, um Zelltrümmer zu entfernen, gefolgt von einer Ultrazentrifugation (Beckman Coulter) bei 112.000 × g für 120 Minuten in einem Rotor vom Typ SW-28, um sEVs zu pelletieren . Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und das Pellet in 1 ml eiskaltem 1× PBS, ergänzt mit 1× Proteaseinhibitor (Complete Mini®, Roche, Basel, Schweiz), resuspendiert. Die sEVs wurden dann auf eine Chromatographiesäule geladen und unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für SF-sEVs45 beschrieben aufgetrennt. Fraktionen, die sEVs enthielten, wurden gepoolt und zweimal 120 Minuten lang bei 112.000 × g unter Verwendung eines Rotors vom Typ SW-28 ultrazentrifugiert. Das resultierende sEV-Pellet wurde in 200 µl PBS, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, resuspendiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Gereinigte sEVs wurden aufgetaut und in 2 % Paraformaldehyd (PFA) resuspendiert. Fünf µl der Proben wurden 20 Minuten lang auf Formvar/kohlenstoffbeschichteten Gittern abgelagert. Die Gitter wurden 3 × 1 Minute mit 1 × PBS gewaschen, dann 5 Minuten mit 1 % Glutaraldehyd inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt von 8 × 1 Minute mit destilliertem Wasser. Die Proben wurden 5 Minuten lang in einem Tropfen Uranyloxalatlösung (pH 7,0) gefärbt und dann 10 Minuten lang mit 4 % Uranylacetat (pH 4,0) und 2 % Methylcellulose auf Eis, vor Licht geschützt, inkubiert. Der Überschuss an Uranylacetat und Methylcellulose wurde durch Abtupfen auf Filterpapier entfernt. Die Gitter wurden 5–10 Minuten lang an der Luft getrocknet und mit TEM, FEI Tecnai™ G2 (ThermoFisher Scientific, USA), bei 80 kV untersucht.

Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wurde mit einem Nano Sight LM10HSB-System durchgeführt, das für schnelle Videoaufnahme und Partikel-Tracking ausgestattet ist, um die Vesikelgrößenverteilungen zu bestimmen. Jede Probe wurde 500-fach verdünnt und in jeweils 5 Durchläufen 30 s lang analysiert, aufgezeichnet mit einer Spritzengeschwindigkeit von 50 unter Verwendung der Kamerastufe 10, der Erkennungsschwelle 8 und der automatisch minimal erwarteten Partikelgröße und automatischen Sprungentfernung in der NTA-Version der Analysesoftware 3.0-Paket.

Volumina von 500 µl SF-sEVs und PC3-sEVs in einer Konzentration von 2 mg/ml wurden zweimal mit PBS gewaschen und 120 Minuten lang bei 112.000 × g ultrazentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 × PBS, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, resuspendiert und weitere 120 Minuten bei 112.000 × g ultrazentrifugiert. Die Pellets wurden dann resuspendiert und in 500 μl 1 × PBS (pH 8,0), ergänzt mit Proteaseinhibitoren und 1 mM EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce, Rockford, IL, USA), 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nicht umgesetztes Biotin wurde durch Zugabe von Tris-HCl auf eine Endkonzentration von 50 mM gequencht und 15 Minuten lang inkubiert. Um freies Biotin zu entfernen, wurden biotinylierte SF-sEVs und PC3-sEVs in PBS verdünnt und 120 Minuten lang bei 112.000 × g ultrazentrifugiert. Die Pellets wurden dann in Lysepuffer (6 M Harnstoff, Proteaseinhibitoren, 1 % n-Octyl-β-D-glucopyranosid (β-OG) in PBS) resuspendiert und 1 Stunde auf Eis inkubiert. Um die Proteinlöslichkeit zu verbessern, wurden die Proben während der Inkubationszeit alle 5 Minuten 5 Sekunden lang verwirbelt und anschließend 30 Minuten lang beschallt. Die Lysate wurden 10 Minuten lang bei 10.000 × g und 4 ° C zentrifugiert, um Ablagerungen zu entfernen. Ein Teil der Lysate wurde gelagert (Gesamtlysat), während der Rest 10-fach in 1 × PBS, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, verdünnt, in drei Röhrchen aufgeteilt (jedes Röhrchen enthält 300 μg der gesamten lysierten sEVs) und mit 5 mg Streptavidin inkubiert wurde Magnetkügelchen (in einer Konzentration von 10 mg/ml; Dynabeads MyOne™, Invitrogen) bei Raumtemperatur (RT) mit End-over-End-Mischen für 60 Minuten. Streptavidin-Kügelchen mit biotinylierten Oberflächenproteinen wurden dann mit einem Magneten gesammelt und dreimal mit 1× PBS mit Proteaseinhibitoren gewaschen, während der Überstand mit den nicht biotinylierten Proteinen (Gesamt minus Oberfläche) bei –20 °C gelagert wurde. Die Proteine wurden aus den Perlen durch 60-minütige Inkubation bei RT in 50 mM DTT in PBS und End-over-End-Mischen eluiert. Eluierte Proteine (Oberfläche) wurden dann mithilfe eines Magneten von den Perlen getrennt und bei –20 °C gelagert. Die Gesamtproteinkonzentrationen für alle Proben wurden mit Dot-it-Spot-it (Maplestone, Knivsta, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Bevor mit HRMS fortgefahren wurde, wurden die Probenqualitäten durch Gelelektrophorese überprüft. Die Proben wurden in 4× LDS-Probenpuffer (Invitrogen) verdünnt, auf ein 4–12 %iges Bis-Tris-Gel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) geladen und 50 Minuten bei 200 V laufen gelassen. Das Gel wurde durch Silberfärbung (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt.

SF-sEVs, PC3-sEVs und PC3-Zellen wurden in RIPA-Puffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ergänzt mit Proteaseinhibitoren, lysiert, durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt und mit dem iBlot2-Trockenblotsystem (ThermoFisher Scientific) geblottet. . Für die Blockierung und Antikörperinkubation wurde LI-COR TBS-Blockierungspuffer (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) verwendet. Die Proteine wurden mit 1,3 µg/ml Anti-TSG101-Antikörper, 0,5 µg/ml Anti-CD9-Antikörper, 0,5 µg/ml Anti-CD81-Antikörper, 0,5 µg/ml Anti-CD63-Antikörper und 0,1 µg/ml Anti-Calnexin-Antikörper analysiert. die mit 50 ng/ml Esel-Anti-Maus-IgG IRDye 680LT oder 75 ng/ml Esel-Anti-Kaninchen-IgG IRDye 800CW als Sekundärantikörper nachgewiesen und mit dem Odyssey-Scanner von LI-COR analysiert wurden. Alle Informationen zu den Antikörpern sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Proteine in der Lösung wurden reduziert, alkyliert und auf dem Filter durch Trypsin verdaut. Getrocknete Peptide wurden in 0,1 % Ameisensäure gelöst und vor der Injektion verdünnt, um für jede Probe die gleiche Menge an Peptiden zu laden. Die Peptide wurden in Umkehrphase auf einer nanoLC C18-Säule unter Anwendung eines 90-minütigen Gradienten getrennt und online auf ein HRMS QE-Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo Finnigan) elektrogesprüht. Die Tandem-Massenspektrometrie wurde unter Anwendung der Kollisionsdissoziation bei höherer Energie (HCD) durchgeführt. Die Datensuche wurde mit dem Sequest-Algorithmus, eingebettet in Proteome Discoverer 1.4 (ThermoFisher Scientific), anhand einer FASTA Uniprot-Datenbank (Homo sapiens, überprüft, veröffentlicht im Mai 2019, 20421 Einträge) durchgeführt. Die Suchparameter wurden auf Taxonomie eingestellt: Homo sapiens; Enzym: Trypsin. Die feste Modifikation war Carbamidomethyl (C), während die variablen Modifikationen Oxidation (M) und Desamidiert (NQ) waren. Die Suchkriterien für die Proteinidentifizierung wurden auf mindestens zwei passende Peptide und ein Konfidenzniveau von 95 % pro Protein festgelegt.

Exo-PLA wurde durch Anpassung des von Löf et al.45 veröffentlichten Protokolls durchgeführt. Kurz gesagt, eine Mischung aus einfangenden Antikörpern aus monoklonalem Maus-Anti-CD9, CD63 und Dipeptidylpeptidase-4 (CD26) (Ergänzungstabelle 1) wurde über konjugierte DNA-Oligonukleotide an Oligonukleotide immobilisiert, die wie zuvor beschrieben auf Magnetkügelchen immobilisiert waren. Eine Liste der Oligonukleotide finden Sie in der Ergänzungstabelle 246. Eine Mischung der drei Antikörper wurde verwendet, um die Effizienz der sEV-Einfangung zu maximieren. Eine Reihe von PLA-Sonden – Oligonukleotid-konjugierte Antikörper – wurden verwendet, um die Oberflächenproteinzusammensetzung eingefangener sEVs zu analysieren. Exo-PLA erzeugt ein Signal, wenn Paare von PLA-Sonden in unmittelbarer Nähe DNA-Kreise erzeugen, die die Bildung von RCA-Produkten steuern, die mit Fluorophor-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden können. Hier stellte eine PLA-Sonde eine Mischung von Antikörpern dar, die gegen zwei bekannte exosomale Oberflächenmarker, Neprilysin (CD10) und Aminopeptidase N (CD13), gerichtet waren, indem dasselbe DNA-Oligonukleotid an die beiden Antikörper gekoppelt wurde. Eine zweite PLA-Sonde wurde hergestellt, indem das entsprechende DNA-Oligonukleotid separat an Antikörper gegen die folgenden sEV-spezifischen Ziele gekoppelt wurde, um Subpopulationen von sEVs zu identifizieren: ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, SEMG1, GAPDS, CRISP1 und CD59 (Ergänzende Daten 1). . Die mit den verschiedenen RCA-Produkten markierten sEVs wurden mittels Durchflusszytometrie auf BD FACS Aria III- oder BD LSR Fortessa-Instrumenten (BD Biosciences) analysiert. Tore für positive Signale in verschiedenen Populationen wurden mithilfe negativer Kontrollen festgelegt, die alle experimentellen Reagenzien außer den Zielen (SF-sEVs oder PC3-sEVs) enthielten. Die Gating-Strategie wird in der ergänzenden Abbildung 6a erläutert. Für jede Reaktion wurden 1 µl mit RCA-Produkten markierte sEVs zur Kontrolle durch Fluoreszenzmikroskopie entnommen. Die Bilder wurden mit einem 40-fachen Plan-Apochromat-Objektiv, NA 1,3, auf einem Zeiss Axio Imager Z2-Mikroskop und einer Digitalkamera Hamamatsu C11440 aufgenommen.

SP-PLA wurde wie zuvor beschrieben49,81 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt wurden 25–35 µg Antikörper gegen die folgenden Proteine gemäß den Anweisungen des Herstellers (Kat.-Nr. 14301, ThermoFisher Scientific) an 5 mg Dynabeads M-270 Epoxy-Magnetkügelchen gekoppelt: Calnexin, TSG101, PTGDS, AKAP4, CD63, SEMG1 und CRISP1 (Ergänzungstabelle 1). Die beiden SP-PLA-Sonden zum Nachweis der Ziel-sEVs wurden durch Kopplung der Streptavidin-konjugierten Oligonukleotide SLC1 und SLC2 (Ergänzungstabelle 2) im Verhältnis 1:1 an biotinylierte Antikörper gegen CD26 bzw. CD9 konstruiert. SF-sEVs und PC3-sEVs wurden im Testpuffer (1 mM D-Biotin, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween-20, 100 nM Ziegen-IgG, 100 µg/ml Lachssperma-DNA, 5 mM EDTA in 1x PBS) verdünnt eine 10-fache Reihenverdünnung, 100 µg/ml–100 pg/ml für SF-sEVs und 70 µg/ml–70 pg/ml für PC3-sEVs. Beim Targeting von CD63 in SF-sEVs wurde eine 10-fache Verdünnungsreihe von 20 µg/ml–20 pg/ml angewendet. Alle Proben wurden dreifach analysiert, auf 200 ng/µl Antikörper-gekoppelten Perlen eingefangen und mit 500 pM jeder SP-PLA-Sonde in einem Reaktionsvolumen von 50 µl Assaypuffer markiert. Echtzeit-PCR wurde in 25-µl-Volumina Amplifikationspuffer durchgeführt (1× PCR-Puffer, 2,5 mM MgCl2, 0,25× Sybr Green, 0,1 µM BioFwd-Primer, 0,1 µM BioRev-Primer, 0,1 µM BioSplint, 0,08 mM ATP, 0,2 mM dNTPs ( mit dUTP), 0,03 U/μl Platinum Taq DNA Polymerase, 0,01 U/μl T4 Ligase und 0,002 U/μl Uracil-DNA Glycosylase) auf einem QuantStudio 6 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), programmiert bei 95 °C für 10 Min , gefolgt von 45 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min.

In dieser Studie wurden insgesamt zwei anonymisierte Proben von SF-sEVs analysiert, die jeweils durch Zusammenführen von Samenplasmaproben von fünf Personen hergestellt wurden. Für die qualitative und semiquantitative Analyse wurden Peptidspektrum-Match-Werte (PSM) verwendet. Die Werte wurden jedoch durch Normalisierung auf den gesamten nPSM transformiert. Fehlende Werte wurden als „missing not at random“ (MNAR)82 behandelt und durch den Wert 0,05 ersetzt (Einzelwert-Imputationsansatz). Der Grad der Anreicherung von Oberflächenproteinen wurde als Verhältnis von nPSM zwischen der Oberfläche und dem gesamten Minus-Oberflächenanteil berechnet. Wenn Replikate verfügbar waren, wurde ein Durchschnittswert berechnet. Die Replikate 1 und 2 der Gesamtlysate der SF-sEVs (ergänzende Abbildungen 1a und 2a) stellten sowohl biologische als auch technische Replikate dar (Rep1 aus Probe 1 und Rep2 aus Probe 2), während die drei Replikate für die Oberfläche und die gesamte Minusoberfläche galten umfasste ein biologisches Replikat und zwei technische Replikate: Rep 1, aus Probe 1 gereinigte SF-sEVs: Rep 2 und Rep 3: aus Probe 2 gereinigte SF-sEVs. Die Signifikanz des berechneten Verhältnisses wurde durch t-Test bewertet. Die Variabilität zwischen den Replikaten wurde als [(Anzahl der für jede Probe eindeutig identifizierten Proteine/Gesamtzahl der Proteine) × 100] berechnet. Die Datenanalyse und -darstellung erfolgte mit der R-Umgebung für statistische Berechnungen und Visualisierung und der Software GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc.). Die identifizierten Proteine wurden mit der Exocarta-Datenbank verglichen. Die in den Supplementary Data 1 aufgeführte Datei zur Proteinannotation wurde von Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/) heruntergeladen. Die Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung Bioinformatics Resources 6.8, NIAID/NIH und das PANTHER-Klassifizierungssystem83 wurden für die Gene Ontology (GO)-Annotation der in den verschiedenen Fraktionen angereicherten Proteine verwendet (Verhältnis ≥2, Anzahl der Replikate ≥2). ). Die Exo-PLA-Daten wurden mit der BD FACS Diva-Software 8.0 (BD Biosciences) analysiert. Für SP-PLA wurden alle Proben dreifach analysiert und die Daten mit der Microsoft Excel-Software analysiert. Abbildung 1a wurde manuell mit der Inkscape-Software erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE84-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD037791 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die Quelldaten, die den Abb. zugrunde liegen. 3, 4 und ergänzende Abbildungen. 1, 2, 4, 5 finden Sie in den Zusatzdaten 1. Die Quelldaten, die der Zusatzabbildung 3 zugrunde liegen, finden Sie in den Zusatzdaten 2. Unbeschnittene und unbearbeitete Western-Blot-Bilder sind als Zusatzabbildung 7 verfügbar.

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Wir danken den auf Massenspektrometrie basierenden Proteomics- und BioVis-Einrichtungen der Universität Uppsala für ihre Unterstützung und Dr. Ahmed Ibrahim für seine Hilfe bei der NTA. Diese Arbeit wurde vom SciLifeLab, Swedish Research Council, im Rahmen der Zuschüsse 2020-02258, 2017-04152, 2018-02943, 2018-06156, 2018-02806 und 2015-4870, Torsten Söderbergs Stiftelse, im Rahmen des Zuschusses M130/16, Swedish Prostate Cancer, unterstützt Federation, Exodiab, die Swedish Cancer Foundation, die Cancer Research Foundations of Radiumhemmet und die Swedish Foundation for Strategic Research im Rahmen des Grant SB16-0046. Die Geldgeber spielten in keinem Teil dieser Studie eine Rolle.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Uppsala.

Die folgenden Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini.

Abteilung für Immunologie, Genetik und Pathologie, Science for Life Laboratory, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini, Radiosa Gallini, Liza Löf, Qiujin Shen, Ryoyo Ikebuchi, Alireza Azimi, Ulf Landegren und Masood Kamali-Moghaddam

JSPS Overseas Research Fellow, Japan Society for the Promotion of Science, Tokio, Japan

Ryoyo Ikebuchi

Abteilung für medizinische Wissenschaften, Klinische Chemie, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Louise Dubois & Anders Larsson

Zentrum für Entdeckung und Innovation, Hackensack Meridian Health, Nutley, NJ, USA

Olivier Loudig

Abteilung für Immunologie und Allergie, Abteilung für Medizin, Karolinska Institutet, Solna, Schweden

Susanne Gabrielsson

Fachbereich Chemie-BMC, Analytische Chemie, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Jonas Bergquist

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MKM, EMD, UL, CF und JB hatten die Idee und planten die Studie. EMD, AA, QS, AL, OL und LD waren an der Produktion und Reinigung von Elektrofahrzeugen beteiligt. EMD und CF führten Experimente zur Proteinanreicherung durch. RG plante und führte Western-Blot- und SP-PLA-Experimente sowie Datenanalysen durch. JB war für die MS-Analyse verantwortlich. CF plante und führte die Datenanalyse der MS-Daten durch. EMD und SG unterstützten NTA. EMD, RI und LL führten Elektronenmikroskopie- und Exo-PLA-Experimente sowie Datenanalysen mit Hilfe von AACF durch, EMD, RG und LL verfassten die Arbeit unter der Aufsicht von MKM. Alle Autoren trugen zur endgültigen Version des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Masood Kamali-Moghaddam.

Ulf Landegren ist Anteilseigner von Navinci und Olink Proteomics und besitzt Rechte an der PLA-Technologie. Andere Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Manouchehri Doulabi, E., Fredolini, C., Gallini, R. et al. Oberflächenproteinprofilierung von aus der Prostata stammenden extrazellulären Vesikeln mittels Massenspektrometrie und Proximity-Assays. Commun Biol 5, 1402 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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Eingegangen: 25. Mai 2021

Angenommen: 08. Dezember 2022

Veröffentlicht: 22. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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